मेथिलीन ब्लूच्या प्रयोगांमध्ये प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजातींचे मापन

दोन प्रयोगशाळा मेथिलीन ब्लूचा प्रयोग करतात आणि दोन्ही त्याला अँटिऑक्सिडंट प्रयोग म्हणतात. एकीच्या अहवालानुसार हा रंगद्रव्य प्रतिक्रियाशील ऑक्सिजन प्रजाती कमी करतो. दुसरीच्या अहवालानुसार तो त्या निर्माण करतो. दोन्ही स्पष्ट मात्रा–प्रतिसाद वक्र दाखवतात. दोन्ही प्रामाणिक आहेत. या फरकामागे फसवणूक किंवा अकार्यक्षमता नाही. दोन्ही गटांनी वेगवेगळ्या प्रकाशस्थितींमध्ये वेगवेगळ्या गोष्टी मोजल्या, वेगवेगळ्या प्रश्नांची उत्तरे देणारे प्रोब वापरले आणि मग दोन्ही उत्तरांचे वर्णन एकाच शब्दाने केले: ROS.

मेथिलीन ब्लूचे अचूक मापन करणे कठीण आहे, कारण ज्या रसायनशास्त्राचे निरीक्षण त्याने करायचे आहे, त्यात तो स्वतः सहभागी होतो. अंधारात तो इलेक्ट्रॉन दात्यांकडून स्वीकारकांकडे इलेक्ट्रॉन वाहून नेतो आणि पुन्हा मूळ रूपात परततो, पुढचे चक्र सुरू करण्यासाठी तयार होतो. प्रकाशात तो प्रकाशसंवेदीकारक बनतो आणि उत्तेजित ट्रिप्लेट अवस्थेत पोहोचतो. त्या अवस्थेतून तो ऑक्सिजनला ऊर्जा देऊन सिंग्लेट ऑक्सिजन तयार करू शकतो किंवा इलेक्ट्रॉन हस्तांतरित करून मुक्त मूलके आणि हायड्रोजन पेरॉक्साइड तयार करू शकतो. या प्रणालीत घातलेल्या कोणत्याही प्रोबचे स्वतः रंगद्रव्यामुळे ऑक्सिडीकरण, क्षपण, विरंजन किंवा प्रकाशीय आच्छादन होऊ शकते. त्यामुळे कोणत्याही ROS मापनाबद्दलचा पहिला प्रश्न आकडा किती आहे हा नसतो. चाचणी प्रत्यक्षात काय ओळखते आणि रंगद्रव्याचा चाचणीवर काय परिणाम होतो, हा असतो.

Amplex Red: अंशांकित हायड्रोजन पेरॉक्साइड चाचणी

योग्य प्रकारे मांडल्यास, या संशोधन साहित्यातील मेथिलीन ब्लू–Amplex Red ही जोड सर्वाधिक विश्वासार्ह आहे. तिचे रसायनशास्त्र विशिष्ट आहे: हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडेज हायड्रोजन पेरॉक्साइड वापरून Amplex क्रियाधाराचे ऑक्सिडीकरण करते आणि साधारण एकास एक स्टॉइकिओमेट्रीमध्ये रेसोरुफिन हा प्रतिदीप्त उत्पादन तयार करते. नमुन्यातील पेरॉक्साइड शोधकात प्रतिदीप्तीच्या रूपात दिसतो. नेहमीच्या ROS समूहातील इतर कोणतीही प्रजाती ही अभिक्रिया थेट घडवत नाही.

या पद्धतीचा निर्णायक फायदा म्हणजे अंशांकन. काळजीपूर्वक काम करणारा संशोधक त्याच बफरमध्ये, पेरॉक्सिडेज आणि क्रियाधाराच्या त्याच सांद्रतांसह, त्याच उष्मायन कालावधीत आणि त्याच प्रकाशीय सेटिंग्जवर ज्ञात पेरॉक्साइड मानके तपासतो आणि मग त्या वक्राच्या आधारे नमुन्यांचे मापन करतो. या पद्धतीला आधार देणाऱ्या, विलग केलेल्या मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात लेखकांनी नेमके हेच केले. प्रत्येक प्रयोगाच्या शेवटी त्यांनी ज्ञात प्रमाणात पेरॉक्साइड घातला आणि आकडे मनमानी प्रतिदीप्ती एककांऐवजी प्रति मिनिट प्रति मिलिग्रॅम प्रथिन पिकोमोल या दराने नोंदवले. यामुळेच केवळ चमक दिसण्याचे रूपांतर मापनात होते.

त्या अभ्यासातील तीन तपशील अनुकरण करण्याजोगे आहेत. प्रथम, लेखकांनी पेरॉक्साइड नष्ट करणाऱ्या कॅटालेजच्या मदतीने संकेत पडताळला. कॅटालेज घातल्यानंतर मेथिलीन ब्लूमुळे होणारी प्रतिदीप्तीतील वाढ थांबली. त्यामुळे हा संकेत पेरॉक्साइडचा होता, प्रकाशीय आभास नव्हता, हे स्पष्ट झाले. दुसरे म्हणजे, त्यांनी उत्तेजन किरणपुंज शटरने नियंत्रित करून प्रकाशाचा परिणाम थेट तपासला. नमुन्यांना नेहमीच्या प्रकाशमात्रेच्या एक अष्टमांश प्रकाश दिल्यावर संकेत केवळ नऊ टक्क्यांनी कमी झाला. त्यांनी नोंदवलेल्या पेरॉक्साइडपैकी नव्वद टक्क्यांहून अधिक पेरॉक्साइड मापनासाठी वापरलेल्या प्रकाशापासून स्वतंत्र होता. तिसरे म्हणजे, त्यांनी इलेक्ट्रोडच्या मदतीने पेरॉक्साइडचे निर्मूलन स्वतंत्रपणे मोजले आणि रंगद्रव्यामुळे उत्पादन वाढते तसेच निर्मूलन मंदावते, असे आढळले. फक्त निव्वळ प्रतिदीप्ती नोंदवणाऱ्या प्रोबने हे दोन परिणाम एकत्र मिसळले असते.

तरीही या चाचणीत त्रुटी निर्माण होऊ शकतात आणि मेथिलीन ब्लूमुळे त्यांपैकी अनेक त्रुटी उद्भवतात. रेसोरुफिन ज्या लाल वर्णपट विभागात प्रकाश उत्सर्जित करतो, त्याच विभागात रंगद्रव्य मोठ्या प्रमाणावर प्रकाश शोषते. त्यामुळे रंगद्रव्याची सांद्रता जास्त असल्यास अंतर्गत फिल्टर परिणामांमुळे नमुना स्वतःच स्वतःचा संकेत झाकू शकतो. म्हणून मानकांमध्ये नमुन्यांइतकीच रंगद्रव्याची सांद्रता असावी. Amplex Red चे स्वतःही प्रकाश-ऑक्सिडीकरण होऊ शकते आणि त्याचे उत्पादन रेसोरुफिन प्रकाशीय रेडॉक्स चक्रात सहभागी होऊन सुपरऑक्साइड आणि पेरॉक्साइड तयार करू शकते. प्रयोगात प्रकाशसंवेदीकारकालाही प्रकाश दिला जात असल्यास ही बाब विशेष महत्त्वाची ठरते. व्यावहारिक उपाय म्हणजे रंगद्रव्य आणि प्रोबला एकत्र प्रकाश देण्याऐवजी आधी मेथिलीन ब्लूच्या नमुन्यांना प्रकाश द्यावा आणि मग त्यांचे मोजून घेतलेले भाग अंधारात Amplex अभिकर्मकांद्वारे तपासावेत. शेवटी, सुपरऑक्साइड डिस्म्युटेज Amplex संकेत केवळ कमी करत नाही: सुपरऑक्साइडचे पेरॉक्साइडमध्ये रूपांतर केल्याने संकेत वाढू शकतो. प्रतिदीप्ती वाढवणारा SOD नियंत्रक प्रयोग अयशस्वी झालेला नसतो. त्याने अभिक्रिया साखळीत आधी निर्माण होणारी प्रजाती म्हणून सुपरऑक्साइड ओळखलेला असतो.

DCFDA: अविशिष्ट ऑक्सिडीकरण निर्देशक

मेथिलीन ब्लू–DCFDA ही जोड बहुतेक गोंधळाचे मूळ आहे. DCFH-DA हा पेशीत प्रवेश करून पुढे रूपांतरित होणारा पूर्वगामी पदार्थ आहे. पेशीतील एस्टरेज त्याचे अॅसिटेट गट काढून टाकतात आणि प्रतिदीप्त नसलेला DCFH उरतो. DCFH चे ऑक्सिडीकरण झाल्यावर प्रतिदीप्त DCF तयार होतो. त्याचे ऑक्सिडीकरण करणाऱ्या घटकांची यादी मोठी आहे: हायड्रॉक्सिल मुक्त मूलके, पेरॉक्सिडेज आणि हीम मध्यवर्ती पदार्थ, नायट्रोजन डायऑक्साइड, हायपोक्लोरस आम्ल आणि पेरॉक्सिनायट्राइटपासून निर्माण होणारी मुक्त मूलके. हायड्रोजन पेरॉक्साइड एकट्याने कोणत्याही उपयुक्त दराने त्याचे थेट ऑक्सिडीकरण करत नाही; पेरॉक्साइडवर अवलंबून असलेल्या प्रतिदीप्तीसाठी साधारणपणे अभिक्रियेत लोह, हीम प्रथिने किंवा पेरॉक्सिडेजचे रसायनशास्त्र आवश्यक असते.

प्रत्येक पद्धतीविषयक विभागाने उद्धृत करावी अशी टीका कल्याणरमण आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांनी DCFH च्या प्रोब म्हणून केलेल्या विश्लेषणातून येते. याच कारणामुळे DCFDA नाकारणाऱ्या मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात या विश्लेषणाचा सारांश दिला आहे. त्यांनी दाखवले की हा निर्देशक संथपणे अभिक्रिया करतो, त्याची स्टॉइकिओमेट्री स्पष्टपणे ठरवलेली नाही, त्याचे वैध अंशांकन नाही आणि तो ROS नसलेल्या संयुगांशीही अभिक्रिया करतो. हा प्रोब ज्याचे मापन करतो, त्यात स्वतः वाढही करतो: DCFH च्या एक-इलेक्ट्रॉन ऑक्सिडीकरणातून DCF मुक्त मूलक तयार होते. ते ऑक्सिजनशी अभिक्रिया करून सुपरऑक्साइड बनवते आणि त्याच्या डिस्म्युटेशनमधून आणखी पेरॉक्साइड तयार होतो. म्हणजे मापन प्रक्रिया ती नोंदवत असलेले रसायनशास्त्र काही अंशी स्वतःच निर्माण करते.

यामुळे DCFDA निरुपयोगी ठरत नाही. मात्र तो प्राथमिक छाननीसाठी उपयोगी आहे, ओळख निश्चित करण्यासाठी नाही. DCF प्रतिदीप्ती वाढणे म्हणजे ऑक्सिडंटवर अवलंबून असलेले प्रोबचे ऑक्सिडीकरण वाढले. त्याचा अर्थ पेरॉक्साइड वाढला असा नाही आणि एकूण ROS वाढले असा तर निश्चितच नाही; एकूण ROS हे कोणताही एक प्रोब मोजत नाही. पूर्वीच्या मेथिलीन ब्लू संशोधनात, एक मायक्रोमोलरपेक्षा अधिक सांद्रतेवर DCF ऑक्सिडीकरणावर अवलंबून असलेल्या अभ्यासांनी प्रोऑक्सिडंट परिणाम नोंदवले. त्याच काळातील इतर प्रणालींमध्ये मात्र पेरॉक्साइडमुळे होणाऱ्या पेशीमृत्यूपासून संरक्षण नोंदवले गेले. वेगवेगळ्या रेडॉक्स परिस्थितींमध्ये एकाच रंगद्रव्याबद्दल दोन्ही निरीक्षणे खरी असू शकतात आणि केवळ DCF च्या निष्कर्षावरून कोणत्या ऑक्सिडंटमुळे संकेत मिळाला हे सांगता येत नाही. आधीच्या मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील संशोधनाचे महत्त्व असे की त्याने या प्राथमिक छाननीच्या जागी अंशांकित पेरॉक्साइड मापन वापरले आणि पेरॉक्साइडचा भार थेट स्पष्ट केला: अगदी शंभर नॅनोमोलर रंगद्रव्यानेही तपासलेल्या प्रत्येक क्रियाधारात आणि श्वसन अवस्थेत पेरॉक्साइड मुक्त होण्याचे प्रमाण अनेक पटींनी वाढवले.

DCFDA मध्ये मेथिलीन ब्लूशी संबंधित आणखी एक विशिष्ट सापळा आहे. हा रंगद्रव्य गडद रंगाचा आणि रेडॉक्स-सक्रिय असल्यामुळे तो प्रतिदीप्तीचे विरंजन करू शकतो, उत्सर्जन शमवू शकतो किंवा पेशीतील ROS पासून स्वतंत्रपणे प्रोबचे ऑक्सिडीकरण करू शकतो. रंगद्रव्य आणि प्रोब असलेला, पण पेशी नसलेला पेशीविरहित नियंत्रक प्रयोग ही ऐच्छिक भर नाही. रंगद्रव्य प्रोबशी परस्परक्रिया करतो का, हे सांगणारा तोच प्रयोग आहे.

स्पिन ट्रॅपिंग आणि ऑक्सिजन ग्रहण: ओळख आणि अभिक्रिया प्रवाह

प्रतिदीप्त प्रोब ऑक्सिडीकरण होऊ शकणारा एखादा पदार्थ तयार झाल्याचे दाखवतात. स्पिन ट्रॅपसह इलेक्ट्रॉन स्पिन रेझोनन्स मात्र तो पदार्थ नेमका काय होता याच्या अधिक जवळचे उत्तर देते. मेथिलीन ब्लूच्या प्रकाशरसायनशास्त्रावरील अभिजात अभ्यासात रंगद्रव्य, अॅस्कॉर्बेट आणि प्रकाश यांच्या संयोगातून निर्माण होणारे अॅस्कॉर्बेट मुक्त मूलक ओळखण्यासाठी ESR वापरले गेले. त्यानंतर ऑक्सिजन ग्रहणाच्या प्रयोगांत पेरॉक्साइड निर्मिती आणि स्पिन ट्रॅपिंगच्या प्रयोगांत लोहाने उत्प्रेरित होणारी हायड्रॉक्सिल मुक्त मूलकांची निर्मिती दाखवण्यात आली. इतर तंत्रांना ज्या प्रश्नाचे उत्तर देता आले नाही, त्याचे उत्तर प्रत्येक तंत्राने दिले: ESR ने मुक्त मूलकाची ओळख दिली, ऑक्सिजन ग्रहणाने कोणत्याही प्रतिदीप्त प्रोबपासून स्वतंत्रपणे अभिक्रिया प्रवाह दिला आणि दोन्हींच्या संयोगाने एकाच प्रकाशित प्रणालीत सिंग्लेट ऑक्सिजन आणि मुक्त मूलकांचे दोन्ही मार्ग कार्यरत असल्याचे दाखवले.

1984 मधील तो निष्कर्ष आजही सावधगिरीचा इशारा वाटतो. प्रकाश आणि क्षपणकारक उपस्थित असताना रंगद्रव्याने पेरॉक्साइड तयार केला आणि लोह उपस्थित असताना प्रणालीने हायड्रॉक्सिल मुक्त मूलक तयार केले, जे या समूहातील सर्वाधिक प्रतिक्रियाशील प्रजाती आहे. लेखकांनी याचा संबंध डोळ्यातील अॅस्कॉर्बेटशी जोडला आणि नेत्रविषयक वापर सहजपणे करण्यावर प्रश्न उपस्थित केला. आजच्या वाचकांनी त्या परिस्थिती लक्षात घ्याव्यात: प्रकाश अधिक क्षपणकारक अधिक लोह. यांपैकी कोणताही एक घटक काढून टाकल्यास तो मार्ग कमकुवत होतो किंवा नाहीसा होतो.

ऑक्सिजन इलेक्ट्रोडचे महत्त्व वेगळ्या प्रकारे सिद्ध होते. क्लार्क प्रकारचा इलेक्ट्रोड निव्वळ ऑक्सिजन वापर मोजतो. त्यामुळे रंगद्रव्यामुळे चालणाऱ्या रेडॉक्स अभिक्रिया आण्विक ऑक्सिजन वापरत आहेत हे स्पष्ट होते आणि कोणत्याही प्रतिदीप्तीजन्य आभासामुळे खोटे ठरवता येणार नाही अशी गतिकी मिळते. मात्र तो उत्पादनाची ओळख सांगत नाही. पेरॉक्साइड, सुपरऑक्साइड आणि पाण्याची निर्मिती, तसेच सिंग्लेट ऑक्सिजनचा ऱ्हास या सर्व प्रक्रियांमध्ये ऑक्सिजन खर्च होतो. ओळखीशिवाय अभिक्रिया प्रवाह जितका अपूर्ण आहे, तितकीच अभिक्रिया प्रवाहाशिवाय ओळख अपूर्ण आहे. म्हणूनच ठोस संशोधन लेख इलेक्ट्रोडसोबत अंशांकित पेरॉक्साइड चाचणी किंवा ट्रॅप वापरतात.

अँटिऑक्सिडंटविषयक निष्कर्षांमध्ये विरोधाभास का दिसतो

ही तीन मापने एकमेकांच्या शेजारी ठेवली की मेथिलीन ब्लूविषयक संशोधनातील वरकरणी विरोधाभासांचे स्पष्टीकरण पद्धतींतील फरक आणि तीन जैविक तथ्यांमधून मिळते.

पहिले म्हणजे, हा रंगद्रव्य इलेक्ट्रॉन वाहकही आहे आणि पेरॉक्साइडचा स्रोतही आहे. ज्या श्वसन स्थळांवर अन्यथा ऑक्सिजनचे सुपरऑक्साइडमध्ये रूपांतर झाले असते, त्यांच्यापासून इलेक्ट्रॉन दुसरीकडे वळवून तो एक ROS कमी करू शकतो. त्याच वेळी त्याचे क्षपित रूप ऑक्सिजनचे थेट पेरॉक्साइडमध्ये क्षपण करून दुसरा ROS वाढवू शकते. त्यामुळे माइटोकॉन्ड्रियातील रेडॉक्स रसायनशास्त्र आणि त्यातील पर्यायी मार्ग पुरवण्याची भूमिका अभ्यासणाऱ्या प्रयोगशाळेने प्रोबनुसार वेगवेगळी उत्तरे अपेक्षित धरावीत: एकाच क्युवेटमध्ये सुपरऑक्साइड-संवेदनशील मापनाचा संकेत कमी होतो, तर पेरॉक्साइड मापनाचा संकेत वाढतो.

दुसरे म्हणजे, कमी मात्रेतील पेरॉक्साइड हा केवळ हानीकारक घटक नसून संकेतही असतो. आधीच्या संशोधनानंतर झालेल्या उंदरांच्या मेंदूच्या माइटोकॉन्ड्रियावरील अभ्यासात अगदी पन्नास नॅनोमोलर रंगद्रव्यापासूनही पेरॉक्साइड निर्मिती होत असल्याचे, पण उपचारात्मक पातळ्यांवर माइटोकॉन्ड्रियल DNA ला हानी होत नसल्याचे आढळले. पूर्वोपचारानंतर रोटेनोनमुळे होणाऱ्या हानीपासून संरक्षणही दिसले. उपचारात्मक मर्यादेपेक्षा खूप जास्त असलेल्या शंभर मायक्रोमोलर सांद्रतेवरच रंगद्रव्याने निवडक DNA तुकड्यांना हानी पोहोचवली. लाल प्रकाश आणि वीस मायक्रोमोलर रंगद्रव्य यांच्या संयोगाने तयार झालेल्या सिंग्लेट ऑक्सिजनने मात्र तपासलेल्या सर्व तुकड्यांना हानी पोहोचवली. प्रस्तावित यंत्रणा हॉर्मेसिसवर आधारित आहे: सौम्य पेरॉक्साइड निर्मिती Nrf2-संबंधित अँटिऑक्सिडंट संरक्षणव्यवस्था आणि माइटोकॉन्ड्रियाची जैवजनन प्रक्रिया सक्रिय करते. त्यामुळे अल्पकालीन प्रोऑक्सिडंट मापनानंतर अधिक दीर्घकालीन अँटिऑक्सिडंट परिणाम दिसतो. एका तासाने वाचलेली चाचणी आणि एका दिवसाने वाचलेली चाचणी यांचे निष्कर्ष वेगळे असू शकतात, कारण त्या दरम्यान जैविक परिस्थिती बदललेली असते.

तिसरे म्हणजे, कोणता रेणू उपस्थित आहे हेही प्रकाश ठरवतो. प्रकाशामुळे रंगद्रव्याचे डिमिथिलीकरण होऊन Azure B आणि संबंधित उत्पादने तयार होतात. डिशवरील सूक्ष्मदर्शकाचा दिवाही त्याला प्रकाशसंवेदनशील करण्यासाठी पुरेसा असतो. अंधारातील आणि प्रकाशातील प्रयोग हे वेगवेगळे प्रयोग आहेत. कोणत्याही कार्यपद्धतीतील प्रकाश आणि रंगद्रव्य हाताळणीचे नियंत्रक प्रयोग या विभागाने त्यांना तसेच मानले पाहिजे.

किमान नियंत्रक प्रयोगांचा संच आणि कोणताही दावा कसा समजून घ्यावा

खालील तुलना ही या लेखासाठी तयार केलेली मूळ संदर्भसामग्री आहे. मेथिलीन ब्लूविषयक कोणताही ROS निष्कर्ष स्वीकारण्यापूर्वी लेखकांनी कोणत्या ओळीतील नियंत्रक प्रयोग केला आणि कोणता वगळला, हे तपासा.

यातून निष्कर्ष वाचण्याचा एक व्यावहारिक नियम मिळतो. पेरॉक्सिडेजसह वापरलेली, अंशांकित आणि कॅटालेजने पडताळलेली Amplex चाचणी हा पेरॉक्साइडविषयीचा पुरावा आहे. DCFDA हा अविशिष्ट प्रोब ऑक्सिडीकरणाचा पुरावा आहे, त्यापलीकडे काहीही नाही. मुक्त मूलक पकडणाऱ्या पदार्थांच्या नियंत्रक प्रयोगांसह केलेले स्पिन ट्रॅपिंग हा मुक्त मूलकाच्या ओळखीचा पुरावा आहे. ऑक्सिजन ग्रहण हा अभिक्रिया प्रवाहाचा पुरावा आहे. चाचणी जितके सिद्ध करू शकते त्यापेक्षा अधिक दावा करणारे वाक्य कितीही आत्मविश्वासाने लिहिलेले असले, तरी ते प्रोबविषयीचे वाक्य आहे, रंगद्रव्याविषयीचे नाही. मात्रेवरील अवलंबित्व आणि हॉर्मेसिसची मर्यादा, माइटोकॉन्ड्रियातील इलेक्ट्रॉन प्रवाह, रंगवलेल्या नमुन्यांतील चाचणीतील हस्तक्षेप आणि सूक्ष्मदर्शकाच्या प्रकाशामुळे निर्माण होणारे आभास यांवरील संबंधित चर्चा या प्रत्येक मुद्द्याचा विस्तार करतात. प्रत्येकाचा तात्पुरता संदर्भ बदलल्यानंतरही हे सर्व मुद्दे वैध राहतात.