मेथिलीन ब्लू आणि ऑटोफॅजी: AMPK, mTOR आणि चेतापेशींवरील प्रयोग

कल्पना करा की तुम्ही पेशींवर प्रयोग करत आहात, त्यात मेथिलीन ब्लू घालता आणि तुमच्या ब्लॉटवर LC3-II नावाच्या प्रथिनाचा पट्टा अधिक गडद झालेला दिसतो. हे संयुग “ऑटोफॅजी वाढवते” असे जाहीर करून पुढे जाण्याचा मोह होऊ शकतो. पण असा अर्थ लावणे घाईचे ठरेल. अधिक गडद LC3-II पट्ट्याचा अर्थ पेशी स्वच्छतेसाठी अधिक पुटिका तयार करत आहेत असा असू शकतो; किंवा विल्हेवाटीचा टप्पा अडकल्यामुळे पुटिका साचत आहेत असाही असू शकतो. हे दोन अर्थ परस्परविरुद्ध दिशांकडे निर्देश करतात, आणि चेतापेशींवरील मेथिलीन ब्लूच्या संशोधन साहित्यात दोन्ही प्रकारच्या पुराव्यांची उदाहरणे आहेत. या लेखात प्रत्येक चाचणीत प्रत्यक्षात काय मोजले गेले, ते क्रमाने पाहू.

येथे अभ्यासलेला प्रकार, मॅक्रोऑटोफॅजी, ही पेशीतील मोठ्या प्रमाणावरील पुनर्चक्रणाची प्रक्रिया आहे. फॅगोफोर नावाची पडद्याची पिशवी झिजलेल्या प्रथिनांभोवती आणि पेशीअंगकांभोवती वाढते, बंद होऊन ऑटोफॅगोसोम बनते, लायसोसोमशी विलीन होते आणि तिच्यातील सामग्रीचे विघटन होऊन ती पुन्हा वापरण्यासाठी मुक्त होते. चेतापेशी या नियमित प्रक्रियेवर अवलंबून असतात, कारण त्या विभाजित होत नाहीत आणि विभाजनाद्वारे खराब झालेल्या घटकांचे प्रमाण कमी करू शकत नाहीत. पुनर्चक्रण थांबले की कचरा साचतो. ते सुरू राहिले की ताणाच्या परिस्थितीत पेशीला मूलभूत बांधणी घटक परत मिळतात.

हिप्पोकॅम्पसच्या पेशींवरील एका प्रयोगात काय दिसले

ऑटोफॅजीच्या प्रवर्तनावरील मुख्य अभ्यासात उंदराच्या हिप्पोकॅम्पसच्या HT22 पेशींना 24 तास सीरमपासून वंचित ठेवून ताण दिला गेला. या स्थितीत वाढीचे घटक आणि पोषण-संवर्धक संकेत काढून घेतले जातात आणि अॅपोप्टोसिस व ऑटोफॅजी या दोन्ही प्रक्रिया सुरू होतात. संशोधकांनी नोंदवले की मेथिलीन ब्लूने मात्रेनुसार पेशीमृत्यू कमी केला आणि या संरक्षणासोबत मॅक्रोऑटोफॅजीची चिन्हेही दिसली.

निर्देशकांमधील बदल विशिष्ट होते. सुमारे 20 nM मेथिलीन ब्लूपासून, सर्वत्र विखुरलेले LC3B अभिरंजन केंद्रकाभोवतीच्या बिंदुरूप ठिपक्यांमध्ये पुनर्वितरित झाले; LC3-I आणि LC3-II चा सर्वाधिक ठळक प्रतिसाद सुमारे 1 μM जवळ दिसला. LC3B-I आणि LC3B-II हे दोन्ही मात्रा आणि वेळेनुसार वाढले. महत्त्वाचे म्हणजे, संशोधकांनी एका वेळबिंदूवरील LC3 ब्लॉटच्या पुढे जाऊन तपासणी केली. त्यांनी लायसोसोमद्वारे होणारा निचरा रोखणारे 10 μM क्लोरोक्विन घातले आणि मेथिलीन ब्लू दिलेल्या पेशींमध्ये अधिक LC3-II तसेच स्थिरावलेले p62 आढळले. हा नमुना केवळ साठा वाढण्याऐवजी लायसोसोमवर अवलंबून असलेल्या निर्मिती-विघटन चक्राला आधार देतो. क्लोरोक्विनने अॅपोप्टोसिसविरोधी परिणाम अंशतः उलटवला, हेही त्यांनी दाखवले; त्यामुळे या मॉडेलमधील संरक्षणाचा संबंध ऑटोफॅजी आणि लायसोसोम मार्गाशी जोडला जातो.

सिग्नलिंगच्या निष्कर्षाचा भाग सर्वाधिक वेळा चुकीच्या अर्थाने उद्धृत केला जातो. फॉस्फोरिलेटेड AMPK आणि त्याचे पुढील लक्ष्य फॉस्फोरिलेटेड ACC यांद्वारे मोजलेले AMPK सिग्नलिंग 12 आणि 24 तासांवर मात्रेनुसार वाढले. शेवटच्या 4 तासांत 20 μM प्रमाणात दिलेल्या AMPK अवरोधक Compound C ने ACC चे फॉस्फोरिलेशन आणि LC3 सक्रियण दोन्ही कमी केले. याउलट, फॉस्फोरिलेटेड mTOR मध्ये मोजता येण्याजोगे दमन दिसले नाही. त्यामुळे ताणाखालील हिप्पोकॅम्पसच्या पेशींमध्ये आढळलेला निष्कर्ष हा वरकरणी mTOR पासून स्वतंत्र मार्गाने होणारे, AMPK शी संबंधित प्रवर्तन असा होता. जिवंत उंदरांमध्येही हाच नमुना दिसला; मेथिलीन ब्लू उपचाराने कॉर्टेक्स आणि हिप्पोकॅम्पसमध्ये मॅक्रोऑटोफॅजीचे निर्देशक वाढले.

प्रवर्तन म्हणजे पूर्ण झालेला फ्लक्स नव्हे

येथे संकल्पनांमधील फरक सर्वाधिक महत्त्वाचा आहे. प्रवर्तन म्हणजे प्रक्रियेच्या सुरुवातीची यंत्रणा अधिक ऑटोफॅगोसोम तयार करते. फ्लक्स म्हणजे सामग्री संपूर्ण मार्ग पार करते: बंदिस्त करणे, परिपक्वता, लायसोसोमशी विलयन, विघटन आणि पुनर्चक्रण. फ्लक्स चाचणीने उर्वरित प्रवासाची पुष्टी करेपर्यंत, LC3-II मधील प्रत्येक वाढ हा प्रवर्तनाचा दावा असतो.

प्रमाणित फ्लक्स चाचणीत बॅफिलोमायसिन A1 किंवा क्लोरोक्विनसारख्या पदार्थाने लायसोसोमची प्रक्रिया अल्पकाळ रोखून आणि ती न रोखता LC3-II मोजले जाते. उपचार खरोखरच निर्मितीचा वेग वाढवत असेल, तर विघटन रोखल्यावर LC3-II आणखी वाढायला हवे. टँडेम mCherry-GFP-LC3 रिपोर्टर आणखी एका दृष्टिकोनातून माहिती देतो: लायसोसोमशी विलयन होण्यापूर्वी रचना पिवळ्या दिसतात, तर आम्लामुळे GFP संकेत विझल्यानंतर त्या फक्त लाल दिसतात. त्यामुळे फक्त लाल दिसणारे ठिपके वाढणे हे आम्लीय ऑटोलायसोसोममध्ये प्रक्रिया पुढे जात असल्याला आधार देते. p62 प्रथिन कमी होणे सामग्रीच्या निर्मिती-विघटन चक्राला दुजोरा देऊ शकते; मात्र p62 चे प्रतिलेखन स्वतःही ताणाला प्रतिसाद देते, त्यामुळे ते mRNA पातळीवर तपासले पाहिजे.

खालील तपासणी यादी या संशोधन साहित्यात वापरलेली प्रत्येक चाचणी काय मोजते आणि ती एकटी काय सिद्ध करू शकत नाही, हे दाखवते. वाचक भविष्यातील कोणत्याही मॅक्रोऑटोफॅजी दाव्यासाठी ही यादी वापरू शकतात; या निर्देशकांचा आधार घेणाऱ्या उपवास आणि दीर्घायुष्याविषयीच्या युक्तिवादांनाही ती लागू होते.

ही तक्ता शब्दप्रयोगातील एका सापळ्यापासून सावध करते. फॉस्फोरिलेटेड ACC हे एन्झाइमच्या दृष्टीने अवरोधित रूप आहे. त्यातील वाढ AMPK चा पुढील प्रतिसाद दर्शवते, ACC चे सक्रियण नव्हे.

“मॅक्रोऑटोफॅजी रोखल्याने चेतापेशींचे संरक्षण नाहीसे झाले” या वाक्यालाही तितकीच नेमकी मांडणी आवश्यक आहे. HT22 मॉडेलमध्ये याचा अर्थ असा की ऑटोफॅजी आणि लायसोसोम मार्गात हस्तक्षेप केल्यावर, सीरमपासून वंचित परिस्थितीत मेथिलीन ब्लूमुळे पेशी टिकून राहण्याचा जो फायदा मिळत होता, तो नाहीसा झाला. त्या प्रयोगातील परिस्थितीत ऑटोफॅजी आवश्यक होती किंवा तिचे योगदान होते, याला हा निष्कर्ष आधार देतो. मात्र ऑटोफॅजी हीच या संयुगाची एकमेव संरक्षणात्मक यंत्रणा आहे असे तो सिद्ध करत नाही; क्लोरोक्विन केवळ ऑटोफॅजीमार्फतच कार्य करते असेही सिद्ध करत नाही. कारणात्मक दावा अधिक ठोस करण्यासाठी ATG5, ATG7 किंवा ULK1 मध्ये आनुवंशिक हस्तक्षेप करणे आवश्यक असेल.

एकाच यंत्रणेकडे जाणारे दोन मार्ग

एक सोपा आराखडा उपयुक्त ठरतो. ऊर्जाविषयक ताण AMPK वाढवतो, AMPK हे ULK1 संकुल सक्रिय करते आणि ऑटोफॅजी सुरू होते. वाढीचे घटक आणि पोषकद्रव्ये mTORC1 वाढवतात, mTORC1 हे ULK1 ला अवरोधित करते आणि ऑटोफॅजी बंद राहते. ULK1 नंतरच्या टप्प्यात Beclin-1 आणि VPS34 संकुल फॅगोफोरची निर्मिती सुरू करते, LC3-I चे लिपिडीकरण होऊन LC3-II बनते, ऑटोफॅगोसोम बंद होतो, लायसोसोमशी विलीन होतो आणि p62 च्या विघटनासोबत सामग्रीचेही विघटन होते.

या आकृतीत मेथिलीन ब्लूचा प्रत्येक निष्कर्ष या आराखड्यावर ठेवला आहे: हिप्पोकॅम्पसमधील निष्कर्ष AMPK शाखेजवळ आणि पूर्वज पेशींमधील निष्कर्ष mTOR शाखेजवळ.

ही चौकट Xie यांच्या दुसऱ्या अभ्यासाशी जाणवणारा वरकरणी विरोधाभास दूर करते. विभाजन करून वाढणाऱ्या उंदराच्या चेतापूर्वज पेशींमध्ये, एका स्वतंत्र प्रयोगात असे आढळले की 5 μM मेथिलीन ब्लूने पेशींचे विभाजन व वाढ रोखली आणि विश्रांती अवस्था वाढवली. 1 आणि 3 दिवसांवर Ki67 पॉझिटिव्ह पेशी कमी झाल्या, तर चेतापेशींमध्ये रूपांतरित होण्यासाठी आधीच निर्धारित असलेल्या पेशींचे विभेदन अबाधित राहिले. येथे यंत्रणा mTOR सिग्नलिंगच्या दमनातून कार्यरत होती: एकूण mTOR आणि फॉस्फोरिलेटेड mTOR कमी झाले, त्यासोबत p70S6K आणि 4EBP1 ची अभिव्यक्ती कमी झाली, तसेच सायक्लिन E1, B1, D1 आणि D2 यांची अभिव्यक्तीही घटली. ठळकपणे दिसलेला परिणाम हा पूर्वज पेशींची विश्रांती अवस्था होता. लेखकांनी त्याचा संबंध पेशीय वार्धक्य उशिरा येण्याशी जोडला, ताणाखालील हिप्पोकॅम्पसच्या पेशींना वाचवण्याशी नव्हे.

या दोन संशोधन लेखांमध्ये विरोधाभास नाही. AMPK आणि mTOR हे संदर्भानुसार विविध संकेत एकत्रित करणारे घटक आहेत, ठरावीक स्विच नव्हेत. ताणाखालील चेतापेशीसदृश पेशी मोजता येण्याजोगे mTOR दमन न होता AMPK सक्रिय करू शकते; तर विभाजनास चालना देणाऱ्या संकेतांनी प्रेरित पूर्वज पेशी त्याच संयुगाला प्रतिसाद म्हणून mTOR वर अवलंबून असलेल्या वाढीच्या यंत्रणेचा वेग कमी करू शकते. पेशीचा प्रकार, ताणाचा संदर्भ, सांद्रता आणि मोजमापाचा वेळबिंदू यांवर कोणती शाखा वरचढ ठरेल हे ठरते. याच कारणामुळे मेथिलीन ब्लूचे मायटोकॉन्ड्रियातील ऊर्जा आणि रेडॉक्सवरील परिणामही याच चौकटीत समाविष्ट होतात: चेतापेशींच्या संरक्षणाच्या यंत्रणांवरील एका आढाव्यात वर्णन केल्याप्रमाणे, हे संयुग पर्यायी इलेक्ट्रॉन वाहक म्हणून कार्य करते, अँटिऑक्सिडंट आणि अॅपोप्टोसिसविरोधी सिग्नलिंगमध्ये सहभागी होते, MAO आणि NOS यांना अवरोधित करते आणि जैवजनन व ऑटोफॅजीमार्फत मायटोकॉन्ड्रियाच्या नूतनीकरणाशी जोडलेले आहे. ऑटोफॅजी ही बहुपरिणामी कार्यस्वरूपाची एक शाखा आहे, संपूर्ण चित्र नव्हे.

हे प्रयोग काय दाखवत नाहीत

सीरमपासून वंचित ठेवणे हे प्रयोगपात्रातील पोषण-संवर्धक आणि चयापचय ताणाचे मॉडेल आहे. ते संपूर्ण सजीवाच्या उपवासाचे मॉडेल नाही: मूलभूत संवर्धन माध्यमात ग्लुकोज, अमिनो आम्ले आणि क्षार शिल्लक असतात, आणि खाण्याशी संबंधित कोणतेही वर्तन अस्तित्वात नसते. संवर्धनातील 20 nM ते 5 μM या सांद्रतांचे केवळ गणिताने मानवी मात्रांमध्ये रूपांतर करता येत नाही, कारण शोषण, प्रथिनांशी बांधले जाणे, रेडॉक्स अवस्था, चयापचय, ऊतींमधील साठा आणि संपर्काचा कालावधी हे सर्व वेगळे असतात.

रुग्णांमध्ये मेथिलीन ब्लूमुळे प्रवर्तित झालेला ऑटोफॅजिक फ्लक्स दाखवण्यासाठी कोणतीही मानवी चाचणी आखण्यात आलेली नाही. यंत्रणेसंबंधीचा पुरावा अजूनही पेशींवरील, शरीराबाहेर जिवंत ऊतींवरील आणि प्राण्यांवरील संशोधनापुरता आहे; प्रत्यक्ष वापरात या निष्कर्षांची लागूयोग्यता दर्शवणारा पुरावा प्राथमिक असल्याचे आढाव्यांमध्ये अजूनही म्हटले जाते. त्यामुळे मेथिलीन ब्लू उपवासासारखे परिणाम घडवते, ऑटोफॅजीमार्फत मानवी आयुर्मान वाढवते किंवा मानवी मेंदूत ऑटोफॅजिक फ्लक्स पूर्ण करते, असे हे अभ्यास दाखवत नाहीत. उपवासाची नक्कल करणारे परिणाम आणि दीर्घायुष्य यांबाबतच्या दाव्यांना स्वतंत्र चिकित्सीय पुरावा आवश्यक आहे. इतर उपयोगांसाठी झालेल्या मानवी मेथिलीन ब्लू चाचण्या केवळ संबंध जोडल्याने ऑटोफॅजी चाचण्या ठरत नाहीत. पोषकद्रव्यांशी संबंधित ताण आणि दीर्घायुष्याच्या मॉडेल्सवरील संशोधन वाचताना ही मर्यादा लक्षात ठेवली पाहिजे.

तुम्ही पुढचा संशोधन लेख वाचताना ही तपासणी यादी क्रमाने वापरा. प्रथम विचारा, कोणत्या शाखेत बदल झाला: AMPK, mTOR की कोणतीही नाही. त्यानंतर विचारा, LC3 निष्कर्षासोबत फ्लक्स चाचणी केली होती की तो निष्कर्ष एकटाच आहे. मग तपासा, मार्ग रोखल्याने फायदा नाहीसा झाला का आणि कोणत्या पद्धतीने तो रोखला होता. या तिन्ही प्रश्नांची उत्तरे देणारा अभ्यास यंत्रणेविषयीच्या ठोस दाव्यास पात्र ठरतो. केवळ पहिल्या प्रश्नाचे उत्तर देणाऱ्या अभ्यासाने परवानगीदर्शक संकेत दाखवला आहे; उर्वरित प्रवासाचा नकाशा अजून तयार झालेला नाही.