मेथिलीन ब्लू आणि नायट्रिक ऑक्साइड: NOS, cGMP आणि रक्तवाहिन्यांतील संकेतन

प्रश्न साधा वाटतो: मेथिलीन ब्लू नायट्रिक ऑक्साइडला प्रतिबंध करते का? प्रयोगशाळेत या प्रश्नाचे चार स्वतंत्र प्रश्नांत विभाजन होते, आणि प्रत्येकासाठी वेगळी प्रायोगिक चाचणी असते. त्यांची गल्लत होणे हेच मेथिलीन ब्लू आणि नायट्रिक ऑक्साइडविषयीचे लेखन ठाम, पण अस्पष्ट वाटण्याचे मुख्य कारण आहे.

नायट्रिक ऑक्साइडचा संकेत म्हणजे चार दुव्यांची साखळी आहे, असे समजा. नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेस तयार करण्यासाठी एका जनुकाचे प्रतिलेखन होते. हे एन्झाइम आर्जिनीनचे नायट्रिक ऑक्साइडमध्ये रूपांतर करते. हा वायू इतर कशाशी अभिक्रिया होण्यापूर्वी विसरणाद्वारे आपल्या लक्ष्यापर्यंत पोहोचतो. विद्राव्य ग्वानिलेट सायक्लेस त्याला ओळखते आणि चक्रीय GMP तयार करते. मेथिलीन ब्लूचे प्रत्येक दुव्यावरील परिणाम प्रकाशित झाले आहेत, पण हा पुरावा वेगवेगळ्या प्रायोगिक व्यवस्था, वेगवेगळ्या सांद्रता आणि वेगवेगळ्या आयसोफॉर्ममधून मिळाला आहे. एका दुव्यावरील निष्कर्ष दुसऱ्या दुव्यावरील क्रिया सिद्ध करत नाही.

प्रस्थापित साखळी, सोप्या शब्दांत

रक्तवाहिनीच्या भित्तीत नेहमीचा क्रम असा असतो. एखादा उद्दीपक एंडोथेलियल पेशीवर क्रिया करतो. eNOS किंवा NOS3 म्हणून ओळखले जाणारे एंडोथेलियल नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेस थोड्या प्रमाणात नायट्रिक ऑक्साइडचा एक लघुकालीन प्रवाह निर्माण करते. हा वायू विसरणाद्वारे शेजारच्या गुळगुळीत स्नायुपेशीत जातो, विद्राव्य ग्वानिलेट सायक्लेसच्या अपचयित लोहयुक्त हीमला बांधतो आणि GTP चे चक्रीय GMP मध्ये रूपांतर वेगवान करतो. चक्रीय GMP प्रथिन काइनेज G सक्रिय करते, कॅल्शियम हाताळण्याची प्रक्रिया बदलते आणि स्नायू शिथिल होतो.

यापासून वेगळी ठेवण्यासारखी आणखी एक साखळी आहे. संसर्गाच्या वेळी किंवा सायटोकाइनच्या संपर्कात आल्यावर पेशी एका वेगळ्या एन्झाइमचे प्रतिलेखन करतात: प्रेरणीय नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेस किंवा iNOS, ज्याला NOS2 असेही म्हणतात. ते eNOS पेक्षा जास्त प्रमाणात आणि अधिक काळ टिकणारे नायट्रिक ऑक्साइड प्रवाह निर्माण करते. तिसरा आयसोफॉर्म, न्यूरॉनल NOS किंवा nNOS, आणखी वेगळ्या संदर्भाशी संबंधित आहे. एखाद्या संशोधन लेखात आयसोफॉर्म न सांगता नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेस असा उल्लेख असेल, तर थांबून नेमका कोणता मोजला होता ते तपासा. मेथिलीन ब्लू इलेक्ट्रॉन कसे वाहून नेते याचा आढावा सर्वसाधारण रेडॉक्स लक्ष्यांसाठीही हाच मुद्दा मांडतो: ही वहन-साखळी स्वतःहून काही करत नाही, आणि प्रत्येक टोकावरील भागीदार परिणाम ठरवतो.

मोजलेले चक्रीय GMP हेही एकत्रित परिणामाचे मोजमाप असते; ती एन्झाइमची थेट चाचणी नसते. त्याची पातळी सायक्लेसद्वारे होणारी निर्मिती वजा फॉस्फोडायएस्टरेजद्वारे होणारे विघटन दर्शवते; रक्तवाहिन्यांच्या गुळगुळीत स्नायूंमध्ये विशेषतः PDE5 महत्त्वाचे असते. त्यामुळे चक्रीय GMP कमी होणे म्हणजे संवेदकापर्यंत कमी संकेत पोहोचला. त्यावरूनच कोणता दुवा निकामी झाला हे कळत नाही.

दुवा 1: iNOS एन्झाइम कमी तयार होते

जिवाणूंच्या लिपोपॉलिसॅकराइडने, इंटरफेरॉन गॅमाने किंवा दोन्हींनी उद्दीपित केलेल्या उंदरांच्या मॅक्रोफेजमध्ये, मेथिलीन ब्लूने iNOS प्रथिनातील अपेक्षित वाढ रोखली आणि मॅक्रोफेज प्रतिलेखनाच्या प्रयोगांमध्ये iNOS संदेशवाहक RNA मोठ्या प्रमाणात दडपला. यात काय बदलले नाही हा भाग महत्त्वाचा आहे. प्रतिबंधक I कॅप्पा B अल्फाचे विघटन, NF कॅप्पा B आणि STAT1 चे फॉस्फोरिलीकरण, तसेच या घटकांचे केंद्रकात जाणे या प्रक्रिया बहुतांशी अबाधित राहिल्या. कमी झाले ते त्यांचे DNA शी बांधले जाणे; क्रोमॅटिन इम्युनोप्रेसिपिटेशनद्वारे iNOS प्रवर्तकावरील त्यांची उपस्थिती कमी झाल्याचे दिसून याची पुष्टी झाली.

हा एन्झाइमच्या प्रमाणावर परिणाम होण्याआधीच्या टप्प्यातील जनुक-नियमनाचा परिणाम आहे; आधीपासून अस्तित्वात असलेल्या एन्झाइमला तात्काळ अडथळा आणणे नव्हे. तो दाहजन्य संकेतनाशी संबंधित आहे, ज्यात प्रथिन तयार होण्यापूर्वी प्रतिलेखन घटकांनी प्रवर्तकाला बांधणे आवश्यक असते. विश्रांतीच्या अवस्थेतील रक्तवाहिनीत सतत कार्यरत असलेल्या eNOS बद्दल यातून थेट काहीही समजत नाही, आणि त्याचे वर्णनही याच मर्यादेत केले पाहिजे.

दुवा 2: अस्तित्वात असलेले NOS एन्झाइम हळू कार्य करते

उंदरांवरील एका अभ्यासात वेगळा टप्पा तपासला गेला. शुद्धीवर असलेल्या नर उंदरांना शिरेतून लिपोपॉलिसॅकराइड दिले गेले; त्यानंतर तीन तासांनी शिरेतून एकतर सलाइन किंवा 3 mg per kg मेथिलीन ब्लू दिले गेले. हायपोथॅलॅमसमधील NOS क्रियाशीलतेच्या अभ्यासात चिन्हांकित आर्जिनीनचे सिट्रुलीनमध्ये रूपांतर मोजून मध्यवर्ती तळाच्या हायपोथॅलॅमसमधील नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेसची क्रियाशीलता ठरवली गेली. केवळ ताण आणि सलाइन यांनी काही प्रमाणात कॅल्शियम-स्वतंत्र क्रियाशीलता प्रेरित केली, आणि लिपोपॉलिसॅकराइडने ती नियंत्रण गटाच्या पातळीच्या सुमारे दहापट वाढवली. मेथिलीन ब्लूने हे दोन्ही प्रेरित घटक नाहीसे केले. त्या ऊतीत, त्या मात्रेवर आणि त्या वेळेच्या बिंदूवर कॅल्शियम-आधारित सतत कार्यरत क्रियाशीलता बदलली नाही.

हा निष्कर्ष जसा लिहिला आहे तसाच वाचा: त्या परिस्थितीत मोजलेली iNOS-प्रकारची क्रियाशीलता दडपली गेली. हे जनुक अभिव्यक्तीचे मोजमाप नाही, आणि eNOS किंवा nNOS यांच्या तुलनेत iNOS साठी कायमस्वरूपी निवडकता असल्याचा पुरावाही नाही. शुद्ध केलेल्या एन्झाइमवरील प्रयोग ही सावधगिरी आणखी अधोरेखित करतात. शुद्ध केलेल्या नायट्रिक ऑक्साइड सिंथेसच्या थेट चाचण्यांत, मेथिलीन ब्लूने 30 micromolar वर सिट्रुलीनची निर्मिती पूर्णपणे रोखली. अर्धे प्रतिबंधन घडवणारी सांद्रता सुपरऑक्साइड डिसम्युटेस नसताना सुमारे 5.3 micromolar आणि ते असताना 9.2 micromolar होती, असे शुद्ध केलेल्या NOS आणि ग्वानिलेट सायक्लेसच्या तुलनेत नोंदवले आहे. शुद्ध केलेल्या nNOS च्या एका वेगळ्या अभ्यासात एन्झाइमला बांधलेल्या हीमचे ऑक्सिडीकरण यात सहभागी असल्याचे सूचित झाले. व्यावहारिक बोध असा की विलग केलेल्या प्रणालींमध्ये NOS चे थेट प्रतिबंधन खरोखर होते; पण हायपोथॅलॅमसमधील निष्कर्षावरून मेथिलीन ब्लू सर्वत्र सर्व सतत कार्यरत NOS ला अप्रभावित ठेवते असा सर्वसाधारण दावा करता येत नाही.

दुवा 3: नायट्रिक ऑक्साइड पोहोचण्यापूर्वीच नष्ट होते

चक्रीय GMP कमी होण्यामागे एन्झाइमला अडथळा आणण्याव्यतिरिक्त दुसरे कारण असू शकते, याचे सर्वात स्पष्ट प्रात्यक्षिक संवर्धित सशांच्या फुफ्फुसीय धमन्यांतील गुळगुळीत स्नायुपेशींमधून मिळते. या प्रयोगरचनेत नायट्रिक ऑक्साइड देणारे पदार्थ थेट घालून अंतर्जात NOS ची गरज पूर्णपणे टाळली गेली. त्यानंतर रक्तवाहिन्यांच्या गुळगुळीत स्नायूंतील सुपरऑक्साइडच्या अभ्यासात मेथिलीन ब्लू तरीही चक्रीय GMP प्रतिसाद दडपते का हे तपासले गेले.

1 ते 100 micromolar या सांद्रतांमध्ये तीन दाते तपासले गेले: S नायट्रोसो L सिस्टीन, सोडियम नायट्रोप्रुसाइड आणि MPANO नावाचा स्थिर, अमीन गट काढलेला समरूप पदार्थ. तिन्हींनी चक्रीय GMP साधारण 1.5 पट ते 12 पट वाढवले. 10 micromolar मेथिलीन ब्लूने पहिल्या दोघांचे प्रतिसाद 51 ते 100 टक्क्यांनी रोखले, तर MPANO चा प्रतिसाद बदलला नाही. मेथिलीन ब्लू केवळ सायक्लेसच्या उत्प्रेरक स्थळाला अडथळा आणत असते, तर दात्यांमधील ही निवडकता समजावणे कठीण झाले असते, कारण तिन्ही दाते पुढील टप्प्यात त्याच एन्झाइमवर परिणाम करतात.

त्यानंतर तीन नियंत्रण प्रयोगांनी ही यंत्रणा सुपरऑक्साइडशी संबंधित असल्याचे निश्चित केले. प्रथम, झॅन्थीन आणि झॅन्थीन ऑक्सिडेस वापरून पेशीबाह्य सुपरऑक्साइड निर्माण केल्यावर तीच पद्धत दिसली: CYSNO आणि नायट्रोप्रुसाइडचे प्रतिसाद रोखले गेले, तर MPANO चा प्रतिसाद अप्रभावित राहिला. दुसरे म्हणजे, मेथिलीन ब्लूमुळे गुळगुळीत स्नायुपेशींमधून मात्रा आणि वेळ यांवर अवलंबून सुपरऑक्साइडची निर्मिती झाली; ती सायटोक्रोम c च्या अपचयनाने मोजली गेली. तिसरे म्हणजे, सुपरऑक्साइड डिसम्युटेसने प्रतिबंधन पूर्णपणे टाळले, तर कॅटालेसने तसे केले नाही. यावरून त्या प्रायोगिक व्यवस्थेत थेट कारणीभूत रासायनिक घटक हायड्रोजन पेरॉक्साइड नसून सुपरऑक्साइड असल्याचे सूचित होते.

या प्रयोगाची सह-संवर्धन आवृत्ती सांगणे महत्त्वाचे आहे, कारण ती परिणाम नेमका कुठे होतो हे दर्शवते. कव्हरस्लिपवरील एंडोथेलियल पेशी थोड्या वेळासाठी गुळगुळीत स्नायुपेशींसोबत सह-संवर्धित केल्या गेल्या. त्यामुळे मूलभूत अवस्थेत मुक्त होणाऱ्या एंडोथेलियल घटकाने गुळगुळीत स्नायूंमधील चक्रीय GMP तीन ते आठ पट वाढवले. या दोन्हीपैकी कोणत्याही पेशीसमूहावर आधी मेथिलीन ब्लूची प्रक्रिया केल्याने तो संकेत कमी झाला, आणि सुपरऑक्साइड डिसम्युटेसने एंडोथेलियल पेशींवरील पूर्वप्रक्रियेचा परिणाम अंशतः उलटवला. दुसऱ्या शब्दांत, मेथिलीन ब्लूने गुळगुळीत स्नायूच्या संवेदक पेशीच्या आतच क्रिया करणे आवश्यक नाही. प्रवासात असलेला संदेशवाहक काढून टाकूनही ते संकेत कमी करू शकते. मेथिलीन ब्लू संशोधन वाचण्याच्या मार्गदर्शकात हा सर्वसाधारण नियम मानला आहे: आण्विक लक्ष्याचे नाव सांगण्याआधी हस्तक्षेप कोणत्या विभागात झाला ते सांगा.

याला NOS प्रतिबंधन म्हणणे चुकीचे ठरेल. दात्यांनी कार्य करण्यासाठी सिंथेसचा कोणताही टप्पा आवश्यक नव्हता, तरीही संकेत कमी झाला.

दुवा 4: संवेदकाचाच प्रतिसाद कमी होतो

विद्राव्य ग्वानिलेट सायक्लेसवर थेट परिणाम होतात, पण सांद्रता महत्त्वाच्या असतात. वर उल्लेखलेल्या शुद्ध एन्झाइमच्या तुलनेत, नायट्रिक ऑक्साइडने उद्दीपित केलेल्या सायक्लेसचे अर्धे प्रतिबंधन करण्यासाठी सुमारे 60 micromolar मेथिलीन ब्लू लागले, तर NOS चे अर्धे प्रतिबंधन सुमारे 5 ते 9 micromolar वर झाले. अगदी 1 millimolar वरही कमाल प्रतिबंधन केवळ अंशतःच झाले. हा फरक साधारण सहा ते अकरा पट आहे. त्यामुळे कमी micromolar सांद्रतेवरील पेशींच्या प्रयोगात चक्रीय GMP कमी झाल्यास, केवळ त्या चक्रीय GMP मूल्याच्या आधारावर त्याला सायक्लेसचे निवडक प्रतिबंधन म्हणता येत नाही.

नंतरच्या एका रेडॉक्स अभ्यासाने आणखी एक सावधगिरी सुचवली: मेथिलीन ब्लूने नायट्रिक ऑक्साइडद्वारे सक्रिय झालेल्या सायक्लेसला निष्क्रिय केले, पण त्याची यंत्रणा हीममधील लोहाचे हवेने होणारे साधे ऑक्सिडीकरण यापेक्षा वेगळी होती. म्हणजे संवेदकाचे कार्य बिघडू शकते, पण त्यामागील रसायनशास्त्र अद्याप निश्चित झालेले नाही. तसेच सांद्रतेतील फरक लक्षात घेता, कमी micromolar सांद्रतेच्या संपर्कात सुपरऑक्साइड आणि NOS यांचे परिणाम आधी वगळले पाहिजेत. फॉस्फोडायएस्टरेजचे नियंत्रणही याच ठिकाणी महत्त्वाचे ठरते. विघटन मोजलेले किंवा रोखलेले नसेल, तर चक्रीय GMP कमी साठणे हे कमी निर्मिती, अधिक वेगवान विघटन किंवा दोन्हींशी सुसंगत असते.

यातून रक्तदाबाबद्दल एकच दावा का करता येत नाही

प्रत्येक दुवा वेगळ्या प्रणालीत प्रस्थापित झाला. मॅक्रोफेजमधील प्रतिलेखन म्हणजे हायपोथॅलॅमसमधील एन्झाइम क्रियाशीलता नव्हे. लिपोपॉलिसॅकराइडनंतरची हायपोथॅलॅमसमधील क्रियाशीलता म्हणजे विश्रांतीच्या अवस्थेतील एंडोथेलियल टोन नव्हे. सह-संवर्धनात मूलभूत अवस्थेत मुक्त होणारा एंडोथेलियल घटक म्हणजे अॅगोनिस्टने उद्दीपित केलेले रक्तवाहिनी विस्तारणे नव्हे. 10 micromolar मेथिलीन ब्लूच्या संपर्कातील संवर्धित फुफ्फुसीय धमनीपेशी म्हणजे मानवी रक्ताभिसरण नव्हे. या सर्वांना एकत्र करून, मेथिलीन ब्लू नायट्रिक ऑक्साइड रोखून रक्तदाब वाढवते, असे विधान करणे म्हणजे नियंत्रण प्रयोगांनी जपण्यासाठी तयार केलेले नेमके हेच भेद बाजूला सारणे.

तीन तपासण्या विवेचनाला अचूक ठेवतात. प्रथम, आयसोफॉर्मचे नाव सांगा: विश्रांतीच्या अवस्थेतील रक्तवाहिनी टोनसाठी eNOS, प्रेरित दाहजन्य प्रवाहासाठी iNOS, आणि न्यूरॉनशी संबंधित तसेच शुद्ध एन्झाइमच्या काही संदर्भांसाठी nNOS. दुसरे, नायट्रिक ऑक्साइड संकेत कसा पुरवला गेला ते सांगा: अंतर्जात निर्मिती, मूलभूत अवस्थेतील एंडोथेलियल मुक्तता, किंवा CYSNO, नायट्रोप्रुसाइड किंवा MPANO यांसारखा विशिष्ट दाता. हे महत्त्वाचे आहे, कारण स्थिर दात्याने मेथिलीन ब्लूच्या परिणामाला प्रतिकार केला, तर अस्थिर दात्यांनी केला नाही. तिसरे, सांद्रता आणि परिणाम उलटवणारे नियंत्रण सांगा: सुपरऑक्साइड डिसम्युटेसने परिणाम उलटणे सुपरऑक्साइडचा सहभाग सूचित करते; कॅटालेसचे अपयश त्या प्रायोगिक व्यवस्थेत हायड्रोजन पेरॉक्साइडचा सहभाग नसल्याच्या बाजूने जाते; झॅन्थीन ऑक्सिडेसने तसाच परिणाम निर्माण करणे त्या यंत्रणेची पर्याप्तता दाखवते; आणि शुद्ध एन्झाइमच्या चाचण्या उत्प्रेरणावरील थेट परिणामांना प्रवासातील नुकसानापासून वेगळे करतात.

थोडक्यात निष्कर्ष असा आहे. मेथिलीन ब्लूला निवडक सायक्लेस प्रतिबंधक मानण्यापेक्षा, नायट्रिक ऑक्साइड ते चक्रीय GMP संकेतनात अनेक ठिकाणी व्यत्यय आणणारा पदार्थ मानणे अधिक योग्य आहे. प्रायोगिक व्यवस्था आणि सांद्रतेनुसार, ते iNOS प्रतिलेखन घटकांचे बांधले जाणे कमी करू शकते, NOS एन्झाइमना थेट प्रतिबंध करू शकते, सुपरऑक्साइड निर्मितीद्वारे नायट्रिक ऑक्साइडची उपलब्धता कमी करू शकते आणि नायट्रिक ऑक्साइडने सक्रिय केलेल्या सायक्लेसचे कार्य बिघडवू शकते. रक्तवाहिन्यांच्या अभ्यासांतील चक्रीय GMP संकेतनाची भूमिका आणि पेशींच्या चाचण्यांत वापरल्या जाणाऱ्या नायट्रिक ऑक्साइड दात्यांची तुलना यांपैकी प्रत्येक लेख या शाखांपैकी एका शाखेचा अधिक तपशीलवार आढावा घेतो. तसेच रेडॉक्स परिणामांना एन्झाइमवरील परिणामांपासून वेगळे करण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या पद्धती हा लेख या साहित्यात सुपरऑक्साइड डिसम्युटेस, कॅटालेस आणि स्थिर दात्याचे नियंत्रण यांचा एकत्र वापर इतक्या वारंवार का दिसतो ते स्पष्ट करतो.

मेथिलीन ब्लूनंतर चक्रीय GMP चे कमी मूल्य साखळी तुटल्याचे दर्शवते. कोणता दुवा तुटला हे फक्त नियंत्रण प्रयोग सांगतात.