लोफ्लरची क्षारीय आणि पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू अभिरंजके: स्पष्टीकरण

अभिरंजनाच्या कार्यमेजावर तीन बाटल्या शेजारीशेजारी ठेवलेल्या असू शकतात; प्रत्येकावर मिथिलीन ब्लूच्या एखाद्या प्रकाराचे नाव असते. एका बाटलीवर जलीय मिथिलीन ब्लू 1% असे लिहिलेले असते. दुसरीवर लोफ्लरचे क्षारीय मिथिलीन ब्लू, तर तिसरीवर पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू असे लिहिलेले असते. कामाच्या घाईत कर्मचारी हाताशी असलेली बाटली उचलतो. मग स्मिअर अगदी फिकट रंगतो, किंवा सर्वत्र एकसारखा निळा दिसतो, किंवा अनपेक्षित जांभळ्या छटा दिसतात; आणि या परिणामाचा दोष नमुन्याला दिला जातो.

ही सूत्रीकरणाची समस्या आहे, नमुन्याची नाही. या तीन द्रावणांमध्ये परस्पर संबंधित रंगद्रव्ये असतात, पण त्यांच्या अभिरंजनाच्या संकल्पना वेगवेगळ्या असतात. एक म्हणजे जवळपास उदासीन pH असलेले साधे धनभारित रंगद्रव्य. दुसरे म्हणजे क्षारामुळे अधिक तीव्रपणे काम करणारे तेच रंगद्रव्य. तिसरे तर एकच रंगद्रव्य राहिलेले नसते; ते जाणीवपूर्वक ऑक्सिडीकरण केलेले मिश्रण असते. चुकीचे द्रावण वापरल्यास तुमच्या हातातील अभिरंजनाचे तत्त्वच बदलते.

थोडक्यात उत्तर

साधे जलीय मिथिलीन ब्लू हा मूलभूत संदर्भ आहे: पाण्यात सुमारे 1% रंगद्रव्य असलेले, जीवाणूंच्या आकाररचनेसाठी आणि सर्वसाधारण सूक्ष्मदर्शकीय निरीक्षणासाठी वापरले जाणारे साधे धनभारित अभिरंजक. लोफ्लरच्या क्षारीय मिथिलीन ब्लूमध्ये पाण्याने विरल केलेल्या अल्कोहोलयुक्त स्टॉक द्रावणात विरल क्षाराचे थोडे, मोजलेले प्रमाण घातले जाते. त्यामुळे pH वाढतो आणि धनभारित रंगद्रव्य जीवाणूंच्या आम्लीय संरचनांशी अधिक तीव्रपणे बांधले जाते. पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू म्हणजे क्षारीय माध्यमात ऑक्सिडीकरण करून जाणीवपूर्वक परिपक्व केलेले मिथिलीन ब्लू. त्यामुळे बाटलीत उरलेल्या मिथिलीन ब्लूसोबत मिथिल गट काढून टाकलेले समजात घटक (azure A, azure B, azure C), थायोनिन आणि मिथिलीन व्हायोलेट यांचे मिश्रण असते; हे मिश्रण वेगवेगळ्या संरचनांना वेगवेगळ्या छटा देते.

फक्त एकच वाक्य लक्षात ठेवायचे असेल तर हे ठेवा: क्षारीकरणामुळे अभिरंजनाची तीव्रता बदलते, तर पॉलिक्रोमिंगमुळे अभिरंजनाचे रंग बदलतात.

सामान्य जलीय मिथिलीन ब्लू: संदर्भबिंदू

सर्वात सोपे सूत्रीकरण म्हणजे पाण्यात विरघळवलेले मिथिलीन ब्लू, सामान्यतः 1% w/v प्रमाणात, क्षार न घालता आणि ऑक्सिडीकरण न करता. यात रंग देणारा घटक म्हणजे क्लोराइड प्रतिआयनासह असलेला मिथिलथायोनिनियम धनायन. हे लहान, सपाट फेनोथायाझिन रंगद्रव्य असून PubChem वरील मिथिलीन ब्लूच्या नोंदीत त्याचे वर्णन मिथिलथायोनिनियम क्लोराइड असे केले आहे. धनायन असल्यामुळे ते न्यूक्लिक आम्लांच्या फॉस्फेट आधारसाखळ्यांशी आणि जीवाणूंच्या पेशीभित्तींवरील आम्लीय गटांशी बांधले जाते आणि फिकट पार्श्वभूमीवर पेशींना निळा रंग देते.

याचा गुण म्हणजे पूर्वानुमान करता येण्याजोगा परिणाम. केंद्रके आणि जीवाणू निळे दिसतात. विरोधाभास मध्यम असतो. फिकट दिसणाऱ्या सूक्ष्मजीवांचे अभिरंजन कमकुवत होऊ शकते; नेमकी हीच मर्यादा दूर करण्याचा लोफ्लरचा उद्देश होता. हे द्रावण ज्या साध्या जीवाणू अभिरंजकांच्या व्यापक गटात येते, त्यासाठी जीवाणूंच्या साध्या अभिरंजनाचे विहंगावलोकन पाहा. इथेही रंगद्रव्याची अचूक ओळख महत्त्वाची आहे: मिथिल ब्लू हा पूर्णपणे वेगळा रेणू आहे, हे मिथिल ब्लू आणि मिथिलीन ब्लू यांतील फरक स्पष्ट करते. त्यामुळे केवळ रंगाच्या नावावरून कॅटलॉगमध्ये शोध घेतल्यास चुकीच्या वर्गातील रंगद्रव्य मिळू शकते.

लोफ्लरचे क्षारीय मिथिलीन ब्लू: तेच रंगद्रव्य, अधिक तीव्र परिणाम

पारंपरिक लोफ्लर कृतीत अल्कोहोलयुक्त मिथिलीन ब्लू स्टॉक द्रावण पाण्यातील विरल क्षारासोबत मिसळले जाते. पाठ्यपुस्तकांतील आवृत्त्यांमध्ये 95% इथेनॉलच्या 30 mL मध्ये 0.3 g रंगद्रव्य आणि त्यासोबत 0.01% जलीय पोटॅशियम हायड्रॉक्साइडचे 100 mL वापरण्यास सांगितले जाते. याच्याशी समतुल्य पर्याय म्हणजे संतृप्त अल्कोहोलयुक्त मिथिलीन ब्लूचे 30 mL, ऊर्ध्वपातित पाण्याचे 100 mL आणि 1% KOH चे 1 mL. यामुळे स्पष्टपणे क्षारीय pH असलेले, सुमारे 0.3% रंगद्रव्याचे वापरण्यास तयार द्रावण मिळते. व्यावसायिक आवृत्त्याही हेच तत्त्व पाळतात. Thermo Fisher च्या सूक्ष्मजीवशास्त्रीय अभिरंजकांच्या कॅटलॉगमध्ये लोफ्लरचे क्षारीय मिथिलीन ब्लू, पॉलिक्रोम आणि जलीय प्रकार हे स्वतंत्र उद्देश असलेले स्वतंत्र कॅटलॉग घटक म्हणून नोंदवले आहेत.

क्षाराचा वापर हीच यातली मुख्य कल्पना आहे. pH वाढवल्यामुळे नमुन्यावरील कार्बॉक्सिल आणि फॉस्फेट गटांमधून प्रोटॉन निघून जातात आणि ऋणभारित स्थळांची घनता वाढते. त्याच वेळी अल्कोहोलयुक्त स्टॉक द्रावण रंगद्रव्य पूर्णपणे विरघळलेल्या स्थितीत ठेवते, त्यामुळे ते या स्थळांपर्यंत मोनोमर स्वरूपात पोहोचते. परिणामी, उदासीन जलीय रंगद्रव्याच्या तुलनेत जीवाणूंचे अभिरंजन अधिक जलद आणि अधिक तीव्र होते; नियमित जीवाणूशास्त्रीय स्मिअरमध्ये परिचित असलेल्या गडद निळ्या दंडाकार आणि गोलाकार जीवाणूंचे रूप दिसते. अभिरंजनासाठी सामान्यतः एक ते तीन मिनिटे लागतात, त्यानंतर पाण्याने धुतले जाते.

याचा पारंपरिक उपयोग लोफ्लर सीरम माध्यमावर वाढवलेल्या Corynebacterium diphtheriae साठी होतो: हे सडपातळ, अनेकदा गदेसारखे टोक असलेले दंडाकार जीवाणू असून त्यांच्यात साठवलेल्या पॉलीफॉस्फेटचे तीव्रपणे रंगणारे मेटाक्रोमॅटिक बाबेस-अर्न्स्ट कण असतात. हे माध्यम आणि अभिरंजक यांची जोडी ऐतिहासिक आहे; दोन्हींचे श्रेय त्याच जीवाणूशास्त्रज्ञाला दिले जाते, आणि कणांचा स्पष्ट विरोधाभास हा तिचा निदानासाठीचा लाभ आहे. घटसर्पाशी संबंधित कामाव्यतिरिक्त, हे अभिरंजक संवर्धनांमधून तयार केलेल्या स्मिअरसाठी सर्वसाधारण जीवाणूशास्त्रीय अभिरंजक म्हणून, चिकित्सीय स्मिअरमध्ये Neisseria ची आकाररचना पाहण्यासाठी, तसेच ग्राम अभिरंजनाची गरज नसताना साधे जलीय निळे अभिरंजक फार फिकट ठरते अशा ठिकाणी वापरले जाते. हे एकरंगी अभिरंजक आहे. आम्लीय असलेली प्रत्येक रचना निळ्या रंगाची एखादी छटा धारण करते. कार्यपद्धतीत रंगांच्या आधारे भेद दाखवणे अपेक्षित असेल, तर केवळ क्षार ते साध्य करू शकत नाही.

एक व्यावहारिक खबरदारी: साठवणुकीदरम्यान आणि कार्बन डायऑक्साइड शोषल्यामुळे क्षारीय रंगद्रव्याची द्रावणे खराब होतात आणि त्यातून अवक्षेप तयार होतो. म्हणून प्रयोगशाळा एकतर मर्यादित प्रमाणात द्रावण तयार करतात किंवा कॅटलॉगमधील तयार द्रावण विकत घेऊन त्याची साठवणुकीतील वैधता पाळतात; प्रत्येक स्लाइडवर गाळ पडत असतानाही जुनी बाटली कशीबशी वापरत राहत नाहीत.

पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू: एक नाव, अनेक रंगद्रव्ये

पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लूची सुरुवात त्याच रंगद्रव्यापासून होते, पण क्षारीय माध्यमात त्याचे नियंत्रित ऑक्सिडीकरण केले जाते. ऐतिहासिकदृष्ट्या याला परिपक्व करणे किंवा पॉलिक्रोमिंग असे म्हटले जात असे. क्षारीय माध्यमात कालांतराने होणारा बदल, कार्बोनेटसोबत तापवणे किंवा डायक्रोमेटसारख्या कारकांनी ऑक्सिडीकरण करणे यामुळे डायमिथिलअमिनो प्रतिस्थापी गटांमधील मिथिल गट टप्प्याटप्प्याने काढले जातात. तयार होणारे उत्पादन एक मिश्रण असते: उरलेले मिथिलीन ब्लू आणि त्यासोबत azure B (एक मिथिल गट काढलेला), azure A व azure C (आणखी मिथिल गट काढलेले), थायोनिन (सर्व मिथिल गट काढलेले), तसेच मिथिलीन व्हायोलेट गटातील ऑक्सिडीकरणाची उपउत्पादने. प्रत्येक घटकाची स्वतःची रंगछटा आणि ऊतींशी बांधले जाण्याची प्रवृत्ती असते. त्यामुळे हे मिश्रण मेटाक्रोमॅटिक अभिरंजन करते: केंद्रके, कण, म्युसिन आणि कूर्चा यांना निळ्या ते लाल-जांभळ्या रंगांमधील वेगवेगळ्या छटा मिळतात.

प्रसिद्ध रक्त अभिरंजकांमागेही हेच रसायनशास्त्र आहे. सुरुवातीच्या संशोधकांना असे आढळले की क्षारीकृत मिथिलीन ब्लू मलेरियाच्या परजीवींची केंद्रके जांभळ्या छटांमध्ये रंगवते; पण त्यांनी वापरलेली जलीय परिपक्व द्रावणे अस्थिर होती आणि काही दिवसांतच त्यांत अवक्षेप तयार होत असे. जांभळ्या रक्त अभिरंजकाचा शोध कसा लागला या आढाव्यात Malachowski आणि Romanowsky यांनी 1891 मध्ये स्वतंत्रपणे हा परिणाम कसा वापरला, रंगद्रव्याचा अवक्षेप स्थिर ठेवण्यासाठी आणि उष्णता न वापरता पातळ रक्तलेप स्थिर करण्यासाठी मिथेनॉलचा वापर कसा सुरू झाला, तसेच Giemsa यांनी नंतर मोजून घेतलेले azure B आणि इओसिन यांचे मिश्रण ग्लिसरॉलच्या साहाय्याने स्थिर करून कसे प्रमाणित केले, याचा मागोवा घेतला आहे. आधुनिक Giemsa-प्रकारची अभिरंजके थेट पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू आणि इओसिन यांच्या मिश्रणातून विकसित झाली आहेत; हेच मिश्रण Romanowsky परिणाम निर्माण करते. इओसिनसोबतची जोडी आणि azure B घटक यांविषयी सविस्तर माहितीसाठी Romanowsky-प्रकारची अभिरंजके आणि azure B व इओसिन यांचा परस्परसंवाद पाहा.

मिश्रण असल्यामुळे पॉलिक्रोम मिथिलीन ब्लू हे या तिन्हींपैकी स्वभावतः सर्वात कमी प्रमाणित असते. त्यातील रंगछटांचा नेमका समतोल ऑक्सिडीकरणाची पद्धत आणि व्याप्ती यांवर अवलंबून असतो. म्हणून ऊतिशास्त्रीय साहित्याचे पुरवठादार ते जुने झालेले लोफ्लर द्रावण म्हणून न विकता, स्वतंत्र कार्यप्रदर्शन चाचण्या केलेले वेगळे उत्पादन म्हणून विकतात. याच्या सामान्य उपयोगांमध्ये मास्ट पेशींतील कण, म्युसिन आणि कूर्चा यांचे मेटाक्रोमॅटिक दर्शन, प्लाझ्मा पेशींचे तपशील, तसेच Goodpasture-प्रकारच्या पॉलिक्रोम पद्धतींनी ऊतींच्या छेदांमधील Helicobacter pylori दाखवणे यांचा समावेश होतो. रंगांच्या आधारे भेद करायचा असेल तर हे योग्य ठरते; पण कार्यपद्धतीत जीवाणूंची स्पष्ट, एकरंगी बाह्यरेखा अपेक्षित असेल तर हा चुकीचा पर्याय आहे.

सूत्रीकरण आणि उद्देश यांची तुलना

हा तक्ता निर्णय घेण्याची पद्धत म्हणून वाचा. नमुना फार फिकट रंगत असेल, तर pH ची संकल्पना बदला आणि लोफ्लरचे अभिरंजक वापरा. सर्वकाही रंगत असेल पण कोणतीही रचना वेगळी ओळखू येत नसेल, तर रंगद्रव्याची संकल्पना बदला आणि पॉलिक्रोम वापरा. लोफ्लरच्या अभिरंजकाने रंगवलेल्या स्मिअरमध्ये कण अतिशय स्पष्ट दिसत असले, पण पर्यवेक्षकाने केंद्रके आणि पेशीद्रव्य एकाच निळ्या रंगात का दिसतात असे विचारले, तर उत्तर असे आहे की कोणतेही क्षारीय एकरंगी अभिरंजक हे भेद दाखवण्याचे काम करू शकत नाही. हा प्रश्न पॉलिक्रोम गटाचा आणि त्याच्या व्युत्पन्न रक्त अभिरंजकांचा आहे.

नेहमी होणारा गोंधळ टाळणे

बहुतेक गोंधळामागे दोन चुका असतात. पहिली म्हणजे लोफ्लरचे अभिरंजक आणि साधे मिथिलीन ब्लू हे एकमेकांच्या जागी वापरता येतात असे मानणे, कारण बाटलीत दोन्ही निळे दिसतात. त्यांचा pH आणि तीव्रता वेगवेगळी असते. लोफ्लरचे अभिरंजक निर्दिष्ट केलेले असताना त्याऐवजी उदासीन रंगद्रव्य वापरल्यास, ज्या कणांच्या विरोधाभासावर कार्यपद्धती आधारलेली आहे, तोच विरोधाभास गमावला जातो. दुसरी चूक म्हणजे कोणतेही जुने किंवा चुकून दीर्घकाळ ठेवलेले क्षारीय निळे द्रावण पॉलिक्रोम समजणे. अनियंत्रितपणे दीर्घकाळ ठेवलेले द्रावण अज्ञात सांद्रतेचे अज्ञात मिश्रण तयार करते. खरे पॉलिक्रोम द्रावण मात्र निश्चित ऑक्सिडीकरण पद्धतींनी तयार केले जाते आणि रक्त अभिरंजकांच्या परंपरेत त्यात मोजून घेतलेले इओसिन मिसळले जाते. इथे इतिहास शिकवण देतो: 1890 च्या दशकातील अस्थिर जलीय परिपक्व द्रावणांची जागा मिथेनॉलयुक्त स्थिरीकृत सूत्रीकरणांनी घेतली, कारण अनियंत्रित मिश्रणे तंतोतंत पुन्हा तयार करता येत नव्हती. किती जुनी आहे हे माहीत नसलेल्या बाटलीतील द्रावणाने निदानासाठीची स्लाइड रंगवण्यापूर्वी ही शिकवण आठवणे योग्य ठरेल.

अचूक नावाची खात्री केल्याने हा गोंधळ पूर्णपणे दूर होतो. रंगावरून अंदाज बांधण्याऐवजी लेबलवरील कॅटलॉग घटकाचा प्रकार (जलीय, लोफ्लर किंवा पॉलिक्रोम), रंगद्रव्याचे प्रमाण आणि अपेक्षित उपयोग तपासा. या तिन्ही सूत्रीकरणांचा रंगधारी गट एकाच मूळातून आलेला आहे. त्यांचा उद्देश मात्र एकच नाही.