मेथिलीन ब्लू आम्लस्थिर रंजनात प्रतिरंजक म्हणून का वापरतात

एक तंत्रज्ञ रंजनाचा संपूर्ण क्रम पूर्ण झाल्यानंतर थुंकीचा स्मिअर तपासतो. निळ्या दृश्यक्षेत्रात लाल दंडाकृती जीवाणू ठळक दिसतात आणि आम्लस्थिर दंडाणू आढळल्याचा अहवाल दिला जातो. दुसऱ्या दिवशी एका वेगळ्या स्लाइडवर एकसारखे निळे दृश्यक्षेत्र दिसते, लाल दंडाकृती जीवाणू दिसत नाहीत आणि तिचा अहवाल क्षयरोगासाठी नकारात्मक असा दिला जातो. या दोन अहवालांपैकी एकात स्लाइडवरून काढता येणाऱ्या निष्कर्षापेक्षा जास्त दावा केला आहे, आणि तो पहिला अहवाल नाही.

हा गोंधळ संकल्पनेतील आहे. तंत्रज्ञाने निळ्या रंजकाला शोधप्रक्रियेच्या रसायनशास्त्राचा भाग मानले, जणू मेथिलीन ब्लू मायकोबॅक्टेरिया शोधण्यास मदत करत होते. प्रत्यक्षात तसे नव्हते. मेथिलीन ब्लू स्लाइडवर पोहोचेपर्यंत चाचणी आधीच पूर्ण झालेली असते. निकाल वाचता यावा म्हणून हे रंजक फक्त पार्श्वभूमी रंगवते. हा लेख आम्लस्थिर रंजनातील मेथिलीन ब्लूचा उद्देश, इतर कोणत्याही रंगाऐवजी निळाच रंग का वापरला जातो आणि निळ्या पार्श्वभूमीवरील लाल रंगावरून कोणते निष्कर्ष काढणे योग्य आहे, हे स्पष्ट करतो.

थोडक्यात उत्तर

आम्लस्थिर रंजन ही तीन संकल्पनांवर आधारित विभेदक चाचणी आहे. प्राथमिक रंजक असलेले कार्बोल फुक्सिन मेणयुक्त मायकोबॅक्टेरियासह प्रत्येक पेशीत सक्तीने प्रवेश करवले जाते. विरंजक असलेले आम्ल-अल्कोहोल सामान्य पेशींमधून लाल रंजक काढून टाकते, पण आम्लस्थिर पेशींमधून ते काढू शकत नाही. त्यानंतर प्रतिरंजक असलेले मेथिलीन ब्लू विरंजकाने रंजक काढून टाकलेल्या सर्व घटकांना रंगवते. त्यामुळे आम्लस्थिर नसलेल्या पेशी, यजमान पेशी आणि अवशेष निळे दिसतात, तर आम्लस्थिर दंडाणू लालच राहतात. प्रतिरंजक रंगविरोध निर्माण करते. पेशीला आम्लस्थिर बनवणाऱ्या रासायनिक प्रक्रियेत त्याची कोणतीही भूमिका नसते.

प्रत्येक टप्पा काय करतो

खालील आकृती कार्यांची विभागणी दर्शवते. प्रक्रिया म्हणून ती डावीकडून उजवीकडे वाचा. रंजनाची प्रत्येक पद्धत वेगळा प्रश्न विचारते, याची आठवण म्हणून खालची पट्टी वाचा.

सर्वप्रथम रंजकाचा आत प्रवेश होतो. मायकोबॅक्टेरियाचे आवरण असामान्यपणे जलविरोधी असल्यामुळे ते सामान्य जलीय रंजकांना प्रतिरोध करते; म्हणून कार्यपद्धतीत रंजकाचा प्रवेश सक्तीने करवला जातो. झील-नील्सन पद्धतीत वाफ येईपर्यंत गरम केल्याने फिनॉलयुक्त कार्बोल फुक्सिन मेणयुक्त पेशीभित्तिकेतून आत जाते. किन्यूनच्या शीत पद्धतीत उष्णतेऐवजी कितीतरी अधिक तीव्र प्राथमिक रंजक मिश्रण वापरले जाते, तर काही सुधारित, उष्णताविरहित प्रकारांत पृष्ठसक्रिय पदार्थही घातले जातात. अमेरिकन सोसायटी फॉर मायक्रोबायोलॉजीच्या आम्लस्थिर रंजन कार्यपद्धती दोन्ही मिश्रणांची माहिती एकत्र देतात. त्यांच्या संहतीतील फरक लक्षणीय आहे: उष्णता वापरणाऱ्या पद्धतीत प्रति 100 mL साधारण 0.3 g बेसिक फुक्सिन, तर शीत पद्धतीत सुमारे 4 g.

दुसरा टप्पा म्हणजे विभेदन. सामान्यतः 97 mL 95 टक्के इथेनॉलमध्ये 3 mL सांद्र हायड्रोक्लोरिक आम्ल घालून तयार केलेले आम्ल-अल्कोहोल, ज्या पेशींची भित्तिका विशेष प्रतिरोध देत नाही अशा प्रत्येक पेशीतून लाल रंजक धुऊन काढते. अखंड मायकोबॅक्टेरियल लिपिड आवरण असलेल्या पेशी रंजक टिकवून ठेवतात. संपूर्ण पद्धतीचा निर्णायक टप्पा हाच आहे आणि तंत्रातील फरकांचा सर्वाधिक परिणामही याच टप्प्यावर होतो, याची चर्चा पुढे केली आहे.

शेवटी रंगविरोध निर्माण केला जातो. आता स्लाइडवर रंजक गमावलेल्या पेशींच्या जवळजवळ रंगहीन पार्श्वभूमीवर लाल आम्लस्थिर पेशी असतात. 0.3 टक्के w/v मेथिलीन ब्लू लाल रंगापासून शक्य तितक्या वेगळ्या रंगात ती पार्श्वभूमी पुन्हा दृश्यमान करते. प्रतिरंजनाचा कालावधी कमी असतो: उष्णता वापरणाऱ्या पद्धतीत साधारण 20 ते 30 सेकंद आणि शीत पद्धतीच्या काही प्रकारांत काही मिनिटांपर्यंत. हा कालावधी रंजकाचा स्वतःचा गुणधर्म नसून कार्यपद्धतीवर अवलंबून असतो.

हेच रंजक का, आणि निळाच रंग का

मेथिलीन ब्लू हे धनायनिक बेसिक रंजक आहे. म्हणजेच त्याचा रंगीत आयन धनभारित असतो आणि विरंजित जीवाणू, यजमान पेशी व अवशेष यांच्या ऋणभारित पृष्ठभागांशी बांधला जातो. OpenStax सूक्ष्मजीवशास्त्र विद्युतभाराचे हे तत्त्व बेसिक रंजकांच्या कार्यामागील सर्वसाधारण तत्त्व म्हणून स्पष्ट करते. मात्र, या बाबतीत मेथिलीन ब्लू रासायनिकदृष्ट्या अद्वितीय नाही. क्रिस्टल व्हायोलेट आणि सॅफ्रॅनिन हीदेखील बेसिक रंजके आहेत. ही निवड रासायनिक नसून प्रकाशीय आहे.

लाल दंडाकृती जीवाणूंसाठी विरोधी रंगाची पार्श्वभूमी आवश्यक असते आणि ब्राइट-फील्ड सूक्ष्मदर्शनात निळा रंग लाल रंगाशी सर्वाधिक उपयुक्त विरोध निर्माण करतो. सॅफ्रॅनिन प्रतिरंजक म्हणून योग्य ठरणार नाही, कारण त्याचा अंतिम गुलाबी-लाल रंग टिकून राहिलेल्या कार्बोल फुक्सिनच्या रंगाशी खूप मिळताजुळता असतो. त्यामुळे प्रक्रियेने निर्माण केलेला फरकच अस्पष्ट होतो. क्रिस्टल व्हायोलेट गडद जांभळी पार्श्वभूमी देईल, जी बारीक लाल दंडाणूंकडे लक्ष जाण्यात अडथळा आणेल. या रंजकाचे काम रासायनिक प्रक्रियेपेक्षा रंगविरोध निर्माण करणे आहे, याचा सर्वात ठोस पुरावा म्हणजे त्याच्या जागी दुसऱ्या रंजकाचा वापर करता येणे: काही पशुवैद्यकीय आणि सुधारित कार्यपद्धतींत मॅलाकाइट ग्रीन व ब्रिलियंट ग्रीन यांसारखी हिरवी प्रतिरंजके वापरली जातात आणि तरीही चाचणी कार्य करते, कारण स्पष्टपणे वेगळी असलेली कोणतीही रंगछटा हेच काम करते.

यातून दोन व्यावहारिक निष्कर्ष निघतात. पहिला, प्रमाणित मिश्रणात pH समायोजन सांगितलेले नाही; हे साधे जलीय 0.3 टक्के द्रावण आणि लोएफ्लरचे मेथिलीन ब्लू यांसारखी क्षारीय मिश्रणे यांची गल्लत करू नका. ती वेगळ्या रंजन संकल्पनेशी संबंधित आहेत. दुसरा, अतिवापर हानिकारक ठरतो. अतिशय गडद निळी पार्श्वभूमी अल्पसंख्य दंडाणू झाकू शकते, असा स्पष्ट इशारा ऊतकशास्त्रीय साहित्यात दिला आहे. त्यामुळे कार्यपद्धतीत सांगितल्यापेक्षा जास्त वेळ स्लाइड रंजकात ठेवून कोणताही फायदा होत नाही; उलट वाचनीयता कमी होते.

चाचणी शक्य करणारे पेशीभित्तिकेचे रसायनशास्त्र

आम्ल-अल्कोहोल हा भेद का करू शकते, याचे कारण मायकोबॅक्टेरियाच्या आवरणात आहे. त्याचा संरचनात्मक गाभा मायकोलिल-अॅराबिनोगॅलॅक्टन-पेप्टिडोग्लायकॅन संकुलाचा असतो: पेप्टिडोग्लायकॅन अॅराबिनोगॅलॅक्टनशी जोडलेले असते आणि त्याच्या बाहेरील टोकांवर अतिशय लांब साखळीची मायकोलिक आम्ले असतात. त्यातून असामान्यपणे कमी पारगम्यतेचे, लिपिडसमृद्ध बाह्य मायकोमेम्ब्रेन तयार होते. मायकोबॅक्टेरियाच्या बाह्य पटलाचा आढावा ही रचना तपशीलवार स्पष्ट करतो. हा अडथळा दोन्ही दिशांनी काम करतो. तो रंजकाच्या प्रवेशाला प्रतिरोध करतो, म्हणून प्रवेशासाठी उष्णता किंवा अधिक तीव्र प्राथमिक रंजक आवश्यक असते. तो रंजक बाहेर काढण्यालाही प्रतिरोध करतो, म्हणून कार्बोल फुक्सिन आत गेल्यानंतर आम्ल-अल्कोहोल ते काढू शकत नाही. सामान्य जीवाणूंमध्ये हे आवरण नसते आणि त्यांच्यातून रंजक निघून जाते. त्यामुळे आम्लस्थिरता ही फुक्सिन मायकोलिक आम्लाशी रासायनिकरीत्या बांधले जाण्याची प्रक्रिया नसून लिपिड अडथळ्यामुळे निर्माण होणारी घटना आहे, असे समजणे अधिक योग्य ठरते.

हे रसायनशास्त्र एका सामान्य कोड्याचेही स्पष्टीकरण देते: ग्राम पद्धतीने मायकोबॅक्टेरियाचे रंजन कमकुवत आणि अनिश्चित होते; कधी ते फिकट मण्यांसारख्या खंडित रूपात, तर कधी न रंगलेल्या अस्पष्ट आकृत्यांसारखे दिसतात. त्यांची जलविरोधी भित्तिका क्रिस्टल व्हायोलेटचा प्रवेश मर्यादित करते. आम्लस्थिर रंजन हा ग्राम रंजनाचा सुधारित प्रकार नाही. ते भित्तिकेच्या वेगळ्या गुणधर्मावर आधारलेले वेगळे विभेदक तत्त्व आहे. इतर दोन पद्धतींचे तत्त्व साधे रंजन आणि ग्राम रंजन यांची तुलना स्पष्ट करते.

तीन पद्धती, तीन प्रश्न

एकाच रंजकाचा वापर करणाऱ्या जीवाणू रंजन पद्धतींच्या व्यापक गटासाठी सूक्ष्मदर्शकीय रंजनाचा चित्रसंग्रह पाहा.

निळ्या पार्श्वभूमीवरील लाल रंग काय सिद्ध करू शकत नाही

लाल दंडाकृती जीवाणू दिसणे म्हणजे त्या जीवांनी आम्ल-अल्कोहोलची क्रिया झाल्यानंतरही कार्बोल फुक्सिन टिकवून ठेवले. हा निष्कर्ष मायकोबॅक्टेरियम ट्युबरक्युलोसिसशी सुसंगत आहे. मात्र, CDC चे क्षयरोग निदान मार्गदर्शन स्पष्टपणे नमूद करते की इतर मायकोबॅक्टेरियाही आम्लस्थिर असतात. त्यामुळे प्रजाती ओळखण्यासाठी संवर्धन आणि न्यूक्लिक आम्ल चाचण्या आवश्यक असतात, केवळ रंग पुरेसा नसतो.

तंत्रातील त्रुटी मुख्यतः धुण्याच्या दोन टप्प्यांभोवती आढळतात. अपुरे विरंजन झाल्यास पार्श्वभूमीतील पदार्थ लाल राहतात आणि चुकीचे सकारात्मक निष्कर्ष निघू शकतात. अतिविरंजनामुळे कमकुवतपणे टिकलेले प्राथमिक रंजक निघून जाते आणि चुकीच्या नकारात्मक निष्कर्षांना हातभार लागतो. प्रतिरंजकाचा अतिवापर केल्यास अल्पसंख्य दंडाणू निळ्या रंगात झाकले जातात. जाड स्मिअर, अवक्षेपित अभिकर्मके आणि दूषित धुण्याचे पाणी यांमुळेही कृत्रिम दृश्यदोष निर्माण होतात.

तंत्र कितीही अचूक असले, तरी संवेदनशीलतेची मर्यादा जीवांच्या संख्येवर अवलंबून असते. पारंपरिक स्मिअर सूक्ष्मदर्शनासाठी प्रत्येक मिलिलिटर थुंकीत साधारण 5,000 ते 10,000 दंडाणू आवश्यक असतात. CDC च्या जुन्या पुरावा-आढाव्यांनुसार संवर्धनाने पुष्टी झालेल्या फुफ्फुसीय प्रकरणांमध्ये स्मिअरची संवेदनशीलता सुमारे 45 ते 80 टक्के होती. त्यामुळे नकारात्मक स्मिअर कधीही क्षयरोग नसल्याचे सिद्ध करत नाही. CDC चे सध्याचे मार्गदर्शन प्रत्येक स्मिअरसोबत संवर्धन करण्यास सांगते. फुफ्फुसीय क्षयरोगाची शक्यता विचारात घेतली जात असेल आणि निकालामुळे रुग्णाच्या वैद्यकीय व्यवस्थापनात बदल होणार असेल, तर किमान एका श्वसनमार्गीय नमुन्यावर न्यूक्लिक आम्ल प्रवर्धन चाचणी करण्याची शिफारसही करते.

प्रत्यक्ष काम अधिकृत कार्यपद्धतींनुसारच करावे

या लेखासह शैक्षणिक वर्णने चिकित्सीय काम करण्याची अधिकृत परवानगी देत नाहीत. प्रत्यक्ष प्रयोगशाळेतील कामासाठी सध्याच्या CDC, APHL किंवा CLSI दस्तऐवजांशी सुसंगत असलेली प्रयोगशाळेची प्रमाणित मानक कार्यपद्धती पाळा. CDC च्या Stacks संग्रहातील आम्लस्थिर रंजनाचा संदर्भ अशा कार्यपद्धतींमध्ये अभिकर्मके आणि निकाल वाचनाचे निकष कसे निश्चित केले जातात, हे दर्शवतो. क्षयरोगाच्या नमुन्यांवर काम करताना जैविक धोका नियंत्रित ठेवणे आवश्यक असते: स्मिअर जैविक सुरक्षा कॅबिनेटमध्ये तयार केले जातात, कारण ते तयार करताना एरोसोल आणि उडणारे थेंब निर्माण होतात. CDC चे प्रयोगशाळा सुरक्षा मार्गदर्शन नमूद करते की उष्णतेने स्थिरीकृत स्मिअरमध्येही जिवंत क्षयरोग दंडाणू असू शकतात आणि ते दूषित असल्याप्रमाणेच हाताळले पाहिजेत. M. leprae च्या तपासणीसाठी कार्बोल फुक्सिन आणि मेथिलीन ब्लूने रंगवलेल्या स्मिअरची CDC सार्वजनिक आरोग्य प्रतिमा संग्रहातील नोंद या पद्धतीचा उपयोग क्षयरोगापलीकडेही होतो, याची उपयुक्त आठवण करून देते: जिथे आम्लस्थिर जीव शोधले जातात, तिथे निळ्या पार्श्वभूमीवरील लाल रंगाचा हाच विरोध उपयुक्त ठरतो. काळजीपूर्वक तपासल्यानंतर मिळालेला नकारात्मक निष्कर्षही नोंद करण्यासारखा निकाल असतो.

तयार स्लाइडचे वाचन

प्राथमिक छाननीदरम्यान प्रतिरंजकाची उपयुक्तता स्पष्ट होते. कमी आवर्धनावर निरीक्षण करणारा सूक्ष्मदर्शक तज्ज्ञ आधी निळ्या पार्श्वभूमीच्या आधारे स्मिअरची गुणवत्ता तपासतो: पेशींचे समान वितरण, फोकस साधण्यासाठी अखंड यजमान पेशी आणि जास्त अवक्षेप नसणे. त्यानंतर संभाव्य लाल दंडाणू लक्ष वेधून घेतात, कारण स्लाइडवरील इतर काहीही लाल नसते. पुष्टी तेल-निमज्जन पद्धतीने होते. त्यात खरे दंडाणू एकसारख्या रंजक अवशेषांऐवजी अपेक्षित बारीक, कधीकधी किंचित वक्र किंवा मण्यांसारखे खंडित दंडाकार रूप दाखवतात.

पार्श्वभूमीचे रंजन अहवालातील शब्दप्रयोगही ठरवते. लाल दंडाणू असलेल्या स्लाइडचा अहवाल आम्लस्थिर दंडाणू आढळले असा दिला जातो; अनेकदा प्रयोगशाळेच्या मापनश्रेणीनुसार अर्धपरिमाणात्मक दर्जाही नोंदवला जातो. लाल जीव न दिसलेल्या स्लाइडचा अहवाल आम्लस्थिर दंडाणू आढळले नाहीत असा दिला जातो, क्षयरोगासाठी नकारात्मक असा कधीही नाही. हा फरक महत्त्वाचा आहे, कारण निळे दृश्यक्षेत्र रंजन झाले, पेशींनी प्रतिरंजक ग्रहण केले आणि प्रकाशीय व्यवस्था पुरेशी होती हे दाखवते; पण शोधमर्यादेपेक्षा कमी संख्येने असलेल्या जीवांबद्दल काहीही सांगत नाही. लाल जीव नसलेले निळे दृश्यक्षेत्र हा स्लाइडबद्दलचा वैध निकाल आहे, रुग्णाबद्दलचा अंतिम निर्णय नाही.

कार्यांची विभागणी लक्षात ठेवल्यास अहवालातील योग्य शब्दप्रयोग सहज स्पष्ट होतो. कार्बोल फुक्सिन संभाव्य जीव दर्शवते. आम्ल-अल्कोहोल चाचणी पार पाडते. मेथिलीन ब्लू फक्त उत्तर वाचनीय करते: लाल रंगाने आम्लाच्या क्रियेनंतरही रंजक टिकवून ठेवले, निळ्या रंगाने ते गमावले. बाकी सर्व गोष्टी—प्रजाती, जीवांची संख्या आणि चिकित्सीय अर्थ—स्लाइडपलीकडील तपासणीतून समजतात.