Метиленско сино и Bartonella: лабораториски наоди и ограничувања на клиничките докази

Садот со култура и пациентот имаат заеднички збор, инфекција, но не и ист концепт. Во садот, инфекцијата се изразува како број на колонии на агар. Кај пациентот, таа подразбира бактерии во клетките и крвните садови, лекови што се движат низ крвта и ткивата и имунолошки систем што извршува дел од работата. Ако ги помешате двете, впечатлива лабораториска бројка почнува да изгледа како третман. Ако ги разграничите, истата бројка останува она што навистина е: причина да се направи следниот експеримент.

Токму тоа разграничување е целата задача на овој преглед за метиленското сино и Bartonella. Две лабораториски студии од една истражувачка група го испитувале метиленското сино против Bartonella henselae во состојби без раст. Обете пријавиле силна активност во стаклени и пластични садови. Ниту една не вклучувала испитување кај човек.

Зошто истражувачите ја испитуваат стационарната фаза

Повеќето испитувања на антибиотици користат клетки во раст. Тој модел пропушта еден потежок случај: клетки што престанале да се делат и поднесуваат лекови што ги убиваат нивните сродни клетки во раст.

Bartonella може да опстојува во телото, вклучително и во еритроцитите и ендотелните клетки. Затоа групата го поставила прашањето кои одобрени лекови можат да ја убијат B. henselae откако ќе влезе во стационарна фаза. Ниска MIC против клетки во раст не го предвидувала убивањето во стационарната фаза. Рифампинот имал многу ниска MIC, но слабо ги убивал стационарните клетки, додека соединенија со повисоки вредности на MIC добро ги убивале. Читателите што сакаат општ метод за читање ваков труд ќе го најдат во водичот за читање истражувања за метиленско сино.

Прво скрининг-испитување: Li и соработниците, 2019

Во скрининг-испитувањето на стационарната фаза од 2019 во Antibiotics бил користен еден сој, B. henselae JK53, одгледуван во подлога Schneider со 10 проценти фетален говедски серум на 37 C со 5 проценти CO2. Еднодневните култури претежно содржеле распрснати клетки што се делеле. Петдневните култури, со околу 10 на 8-ми степен единици што формираат колонии на mL, биле сметани за култури во стационарна фаза и содржеле видливи агрегати.

Тестот користел SYBR Green I со пропидиум јодид, калибриран со мешавини од живи клетки и клетки убиени со изопропанол. Бидејќи метиленското сино е силно обоено, позитивните наоди биле потврдени со микроскопија, а потоа и со броење колонии на крвен агар, што е построг краен показател.

Од 1,581 одобрени лекови испитани при 50 микромоларна концентрација, метиленското сино оставило 16 проценти вијабилност според читачот на микроплочи и 25 проценти според микроскопијата. За даптомицин биле измерени 21 проценти, за неколку азоли 22 до 27 проценти, за гентамицин 32 проценти, за еритромицин 66 проценти, а за ципрофлоксацин 74 проценти. Пирвиниум памоатот покажувал посилен резултат на читачот, но не можел да се оцени со микроскопија поради сопствената флуоресценција.

Против B. henselae во раст, MIC на метиленското сино била 0.08 до 0.16 микрограми на mL. Кај петдневните стационарни клетки, при 5 микрограми на mL, по еден ден изложеност немало детектибилни колонии, исто како кај даптомицинот и пирвиниум памоатот при нивните испитани концентрации. Во одделен тест за убивање во зависност од времето биле користени 10 микрограми на mL. Тоа се лабораториски нивоа на изложеност, а не дози, и трудот ги наведува како такви. Цитирана врвна плазматска вредност кај човек од околу 3.9 микрограми на mL се појавува во трудот само како контекст. Прегледот на фармакокинетиката на метиленското сино објаснува зошто плазматска вредност не може да се толкува како ткивна вредност.

Во трудот се изречно наведени две ограничувања. Немало модел на биофилм, ниту испитување комбинации со метиленско сино. Петдневните агрегати биле групирани клетки во стационарна течна култура, а не валидиран експеримент со биофилм. Авторите повикале на испитувања кај животни, на комбинации, на биофилмови и на други видови Bartonella.

Комбинации и клетки добиени од биофилм: Zheng и соработниците, 2020

Во последователната студија од 2020 во BMC Microbiology биле задржани истиот сој и подлогата, но се преминало на шестдневни стационарни култури и биле додадени две работи што недостасувале во првиот труд: комбинации од два лека и модел со клетки добиени од биофилм.

При испитување поединечни лекови со иста концентрација од 5 микрограми на mL во текот на 24 часа, метиленското сино оставило 3.2 пати 10 на 4-ти степен единици што формираат колонии на mL, наспроти околу 2.8 пати 10 на 10-ти степен во контролата. Ципрофлоксацинот, гентамицинот и нитрофурантоинот оставиле помалку колонии во истиот временски момент. Тоа се разликува од резултатот од 2019, кога истата номинална концентрација довела до отсуство на детектибилни колонии по еден ден. Староста, густината и начинот на ракување со културите се разликувале, па убивањето било повторливо во насоката на ефектот, но не и идентично по обем. Оваа разлика меѓу повторени испитувања е една од причините поради кои стандардните проверки на безбедноста и интеракциите ја разгледуваат лабораториската потентност одделно од клиничкиот ефект.

Скринингот на комбинациите е најчесто цитираниот дел. Секоја компонента била фиксирана на 5 микрограми на mL. И азитромицин со метиленско сино и рифампин со метиленско сино дале резултат без детектибилни колонии од стационарната фаза по 24 часа, како и обете комбинации со ципрофлоксацин; само тие четири од 25 испитани парови го постигнале тоа. Не била спроведена формална анализа на синергијата, па точниот израз е активна комбинација во овие услови, а не докажана синергија.

Експериментот со биофилм испитувал клетки добиени од млад, разбиен биофилм, а не продирање во недопрен зрел биофилм. Културите биле одгледувани пет дена, разредени во плочи со бунарчиња за уште пет дена, потврдени со боење со кристал виолет, а потоа изгребани пред изложувањето на лековите. При 5 микрограми на mL, само метиленско сино го намалило бројот на 2.3 пати 10 на 2-ри степен до ден 6, со што било меѓу најдобрите поединечни средства, но не достигнало нула. Обете комбинации со метиленско сино достигнале нула до ден 6, како и обете комбинации со ципрофлоксацин.

Авторите ги истакнале истите ограничувања што би ги забележал внимателен читател: млад изгребан биофилм наместо стар недопрен биофилм, една практично избрана концентрација за сите лекови наместо реалистична врвна концентрација за секој лек, само избрани парови со азитромицин или рифампин, еден сој, без животни, без пациенти. Подоцнежно испитување на комбинации од три лека било предложено, но не и пријавено.

Споредба на дизајнот на студиите

Табелата ја прикажува суштината на овој напис во компактна форма. Сè лево од последната колона е работа со култури. Ништо од двата труда не спаѓа во последната колона.

Bartonella не е Borrelia

Двата труда ја споменуваат Borrelia burgdorferi, спирохетата што предизвикува Лајмска болест, бидејќи тестот со бои потекнува од претходна работа со Borrelia во стационарна фаза во истата лабораторија, каде што метиленското сино и даптомицинот исто така биле издвоени како активни средства. Таа историја е корисен контекст и чест извор на грешки.

Ниту еден експеримент во двата труда за Bartonella не ја испитува Borrelia паралелно со Bartonella. Организмите се разликуваат, подлогите се разликуваат, концентрациите се разликуваат, а претпоставениот ефект на метиленското сино врз мембраната кај Bartonella бил наведен како шпекулација што бара дополнително истражување. Резултатите не треба да се пренесуваат од еден вид на друг, а ниту еден труд не поддржува широки тврдења за паразити. Токму затоа споредбата на перзистентните клетки на Borrelia и Bartonella ги разгледува одделно двете групи литература.

Зошто културите не се претвораат во протокол

Разбирлив е интересот за пребарување протокол со метиленско сино за Bartonella. Овие трудови се причината поради која таа фраза треба да се третира како предупредувачки знак, а не како список за купување.

Прво, 5 микрограми на mL во бунарче не е рецепт. Таа вредност не содржи информации за апсорпција, дистрибуција, врзување за протеини, внатреклеточно продирање или подносливост. Авторите ја избрале како приближен просек на врвните концентрации на антибиотици и навеле дека идните испитувања треба да го користат секој лек на неговото реалистично ниво.

Второ, нула колонии значи дека нема колонии во тие услови на засејување, а не стерилно ткиво. Перзистентните клетки, внатреклеточните бактерии и ограничувањата на земањето примероци се надвор од она што го покажува агарната плоча.

Трето, комбинациите што стерилизираат бунарче може да бидат неуспешни или штетни во телото. Азитромицин со метиленско сино и рифампин со метиленско сино се лабораториски парови при лабораториски изложености. Без фармакокинетички испитувања кај животни и контролирани податоци кај луѓе, нема утврдена доза, времетраење или сооднос меѓу користа и ризикот. Секој што разгледува опции треба да ги разговара со лекар и да се информира кога употребата на метиленско сино бара медицински надзор, пред да извлече каков било заклучок од податоците добиени во садови.

Тесно ограничениот заклучок што овие трудови навистина го поддржуваат е следниов: метиленското сино има повторлива активност против B. henselae JK53 што не расте in vitro, вклучително и во лабораториски комбинации од два лека, при што најсилните резултати за комбинациите и за клетките добиени од биофилм потекнуваат од студијата од 2020. Сè друго, вклучително и дали таа активност има значење за бартонелозата кај луѓето, останува неиспитано.