Апсорпциски спектар на метиленско сино и моларна апсорптивност: референтен преглед со наведени услови

Спектарот на метиленското сино изгледа едноставно сè додека не се обидете повторно да употребите некоја бројка од него. Една лабораторија пријавува моларен коефициент на екстинкција близу 82,000. Друга пријавува 67,000. Трета пријавува над 100,000. Сите три можат точно да ги опишуваат сопствените мерења, а ниту една од нив не е универзална константа за бојата.

Забуната произлегува од мешањето на два различни поими. Апсорбанцата е мерење извршено на конкретен раствор во конкретна кивета. Моларната апсорптивност, често означувана како epsilon, е параметар во моделот на тој раствор. Кога метиленското сино ја менува својата состојба на асоцијација, се менува моделот, па се менува и параметарот. Корисна навика е секој коефициент да се третира како вредност со наведени услови: брановата должина, растворувачот, pH или пуферот, температурата, концентрациониот опсег и должината на оптичкиот пат одат заедно со бројката.

Мономерната лента во разреден воден раствор

Во разреден воден раствор, доминантната лента на катјонот на метиленското сино се наоѓа близу 664 до 665 nm, а најчесто се наведува во опсегот од 664 до 668 nm, зависно од инструментот и изборот на калибрација. Таа лента е правилниот избор за квантитативно определување кога растворот е доволно разреден за најголемиот дел од бојата да биде во мономерна форма.

Три вредности од литературата покажуваат зошто условите се поважни од самата бројка. Истражувачи на глини, кои ги одржувале водените примероци под околу 7 микромоларни во кивети од 1 cm, пријавиле epsilon од околу 82,000 M-1 cm-1 при 665 nm. Таа вредност е особено добро документирана како емпириски наклон на калибрациската права за многу разредени водени примероци. Подоцнежна примарна калибрација во дејонизирана вода, со концентрации од 2.34 до 37.52 микромоларни и оптички пат од 1 cm, дала околу 67,100 M-1 cm-1 при 665 nm за вкупната боја. Понискиот резултат е очекуван, а не противречен, бидејќи горната половина од тој калибрациски опсег веќе содржи значително количество димер. Третата вредност, околу 73,460 M-1 cm-1 при 664 nm, потекнува од истражување при pH 6.86 и 293 K во кое набљудуваниот спектар бил разложен на мономерни и димерни делови, како што е сумирано во неодамнешен критички преглед на фотофизиката на метиленското сино. Таа бројка претставува мономерна компонента добиена со деконволуција, а не директен наклон на апсорбанцата во однос на вкупната боја.

Практичната поента: изберете го коефициентот чии услови се совпаѓаат со вашите примероци или направете сопствена калибрација. Не преземајте ја вредноста 82,000 за анализа во фосфатен пуфер со концентрација од 30 микромоларни и не претпоставувајте дека линеарноста сè уште важи.

Рамото на пократки бранови должини е мешавина

Со зголемувањето на концентрацијата, рамото близу 600 до 615 nm расте во однос на максимумот при 664 nm. Современите истражувања обично го лоцираат придонесот на димерот од тип H близу 605 до 610 nm. Глобалната спектрална анализа на метиленското сино во вода издвојува димерен максимум при 607 nm и максимум на повисок агрегат при 600 nm, со мономерни резонантни компоненти при 664 и 650 nm. Целосниот текст е достапен преку записот со отворен пристап за PMID 33251415.

Тоа рамо не треба да се означува како чиста димерна апсорбанца. Мономерната вибронска структура исто така придонесува во истата област, па измерената висина е суперпозиција. Едно глобално фитување покажало дека моделот со мономер и димер не бил соодветен низ целиот опсег од 1.1 микромоларни до 3.4 милимоларни, додека додавањето тетрамер дало најдобро совпаѓање, со тетрамерен сигнал што можел да се открие веќе под 34 микромоларни. Интензитетите на компонентите добиени со фитување биле големи: околу 107,800 M-1 cm-1 при 664 nm за главната мономерна компонента, околу 101,400 за димерот при 607 nm и околу 138,500 за тетрамерот при 600 nm, во непуферирана дејонизирана вода со натриум хлорид од 0 до 0.15 M и температури од 282 до 333 K. Тоа се делови издвоени со модел, па не смеат да се користат како замена за емпириски наклон според Бер–Ламбертовиот закон.

Јачината на димеризацијата е директно квантифицирана. При pH 6.86 и 293 K, едно истражување добило константа на димеризација близу 3,900 M-1. Таа големина објаснува зошто работен раствор од 5 микромоларни се однесува речиси линеарно, додека основен раствор од 50 микромоларни не се однесува така. Корисна проверка при развојот на методот е односот меѓу апсорбанцата близу 610 nm и апсорбанцата близу 665 nm. Кога тој однос расте со концентрацијата, epsilon при 664 nm повеќе не опишува еден непроменлив хемиски вид.

Во концентрационен интервал во кој доминира еден пар хемиски видови што меѓусебно се претвораат, спектрите можат да имаат заедничка изосбестичка точка, експериментално близу 625 nm во водени серии. Јасна неподвижна точка е во согласност со присуството на два доминантни хемиски вида. Кога точката се поместува или исчезнува со зголемувањето на концентрацијата, сметајте го тоа за предупредување дека се појавиле повисоки агрегати или промени во рамнотежите, а не за инструментална грешка.

Растворувачот, pH и температурата го поместуваат спектарот

Водата ја фаворизира асоцијацијата. Додавањето диметил сулфоксид ја потиснува димеризацијата, ги поместува максимумите на апсорпција и флуоресценција кон подолги бранови должини и го зголемува квантниот принос на флуоресценцијата приближно четирикратно, според истражувањето на метиленското сино во вода и смеси со DMSO, индексирано како PMID 30933781. Во тоа истражување водените спектри се разгледуваат како мономерно-димерна рамнотежа, со мономерна апсорбанца близу 650 до 670 nm и димерна апсорбанца близу 580 до 615 nm, а константите на димеризација се изведуваат од спектрите при 293.15 K.

Алкохолите ги поместуваат и положбата и привидниот интензитет, но не ја елиминираат агрегацијата. Во една примарна споредба при концентрација од 31.3 микромоларни и собна температура, пријавена во истражување на метиленското сино во различни растворувачи, максимумот на подолги бранови должини бил 665 nm во вода, но 655 nm во метанол, со привидни вредности за вкупниот раствор близу 37,100 во вода и 60,800 во метанол. Посебна валидација во апсолутен етанол при 298 K дала максимум при 655 nm со epsilon близу 68,000.

Вообичаените промени на pH го поместуваат спектарот помалку отколку што претпоставуваат многу протоколи. Критичкиот преглед цитиран погоре наведува дека од приближно pH 2 до pH 12, максимумот останал близу 665 nm, со само мали промени во интензитетот до pH 11. Видот на пуферот и јонската јачина можат да влијаат на резултатите исто толку колку и номиналната pH, па запишете ги конкретниот пуфер и солта, а не само отчитувањето од pH-метарот. Силна киселина или силна алкалија е посебен случај, бидејќи бојата може да претрпи хемиска промена наместо реверзибилна асоцијација. Температурата и солта исто така ја поместуваат рамнотежата, поради што во истражувањето во вода од 2020 намерно биле менувани двете.

Мерење со кое бројката останува валидна

Квантитативната работа се темели на Бер–Ламбертовата релација, според која апсорбанцата е еднаква на epsilon помножен со концентрацијата и должината на оптичкиот пат, како и на доказ дека линеарниот интервал навистина важи под вашите услови.

Користете кивета од 1 cm за работа со ниски микромоларни концентрации. Со epsilon близу 82,000, концентрација од 5 микромоларни дава апсорбанца близу 0.41, а 10 микромоларни дава околу 0.82. За мерење насочено кон мономерот во чиста вода, побезбедно е да останете близу или под приближно 5 до 7 микромоларни отколку да калибрирате длабоко во опсегот од десетици микромоларни. За концентрирани основни раствори, скратете го оптичкиот пат наместо да прифаќате апсорбанца далеку над 1.

Користете слепа проба со идентична матрица: ист квалитет на вода, ист удел на корастворувач, ист пуфер и соли, без бојата. Подгответе ги калибрациските раствори во истата матрица и на истата температура. За време на развојот скенирајте го целиот видлив опсег, идеално околу 550 до 750 nm, наместо да отчитувате само една бранова должина. Следете ја формата, не само висината. Ако сериското разредување ја менува нормализираната форма, системот хемиски зависи од концентрацијата. Стабилен максимум и стабилен однос на апсорбанците при 610 и 665 nm се посилен доказ за прифатлив опсег отколку само висока вредност на R на квадрат.

Документирајте ја формата на реагенсот. Комерцијалниот материјал може да биде безводен метилтиониниум хлорид или хидрат, како што е трихидратот, па моларната маса што се користи за пресметките на основниот раствор мора да одговара на материјалот во конкретното шише. Само овој чекор објаснува дел од несогласувањето меѓу номиналните моларни концентрации во различни лаборатории. Слична дисциплина е потребна кога резултатите се користат во пресметки за квантитативни анализи, кога спектрите служат за проверка на стабилноста на формулациите и кога профилите на нечистотии бараат преглед на чистотата и спецификациите.

Резиме со наведени услови

Користете ја оваа табела како почетен образец за лабораториска евиденција, а не како извор на меѓусебно заменливи константи.

Брановата должина на апсорбанцата на метиленското сино, значи, е краток одговор со долга фуснота. Наведете го максимумот што сте го измериле, во растворот што сте го измериле, при концентрацијата што сте ја измериле. Таа навика спречува една вредност близу 664 nm од разреден воден раствор да се претвори во лажна универзална константа.