Vaiga šūnu krāsošana ar metilēnzilo: ko novērot

Skolniece uzpilina vaiga šūnu suspensijas pilienu uz priekšmetstikliņa, ieskatās mikroskopā un gandrīz neko neredz. Gaišajā redzes laukā slīd dažas blāvas ēnas. Viņa pielāgo fokusu, tad palielina apgaismojumu un visbeidzot secina, ka preparāts ir tukšs. Taču preparāts nav tukšs. Šūnas tur ir. Tās ir gandrīz caurspīdīgas, un tieši caurspīdīgums ir problēma, kuras risināšanai paredzēta šī krāsošana.

Šo neatbilstību starp gaidīto un redzamo ir vērts izskaidrot pirms darba sākšanas. Iesācēji sagaida, ka mikroskops atklās detaļas tāpat, kā kameras tālummaiņa ļauj izlasīt tālu esošu uzrakstu. Gaišā lauka mikroskops dara kaut ko šaurāku: tas parāda gaismas absorbcijas atšķirības. Nekrāsota vaiga šūna gandrīz neabsorbē gaismu, tāpēc arī gandrīz nerada atšķirību. Metilēnzilais šo atšķirību piešķir. Tas nevienmērīgi saistās šūnas iekšienē un padara struktūru redzamu ar kontrasta palīdzību. Kad skolēni šo principu saprot, katrs turpmākais solis kļūst par loģisku secinājumu, nevis vienkārši recepti.

Te noder pamatzināšanas par to, kā vienkāršā krāsošana palielina kontrastu skolas laboratorijā, savukārt atgādinājums par gaišā lauka mikroskopa iestatīšanu pirms krāsošanas palīdz novērst pusi neveiksmīgo preparātu. Krāsas ķīmiskais pamats aplūkots ievadā par metilēnzilo mikroskopijā, kur izskaidrots, kāpēc tieši šī krāsviela tik bieži sastopama uz laboratorijas galda.

Mācību nodarbības protokols

Tālāk aprakstītais mitrā preparāta variants ir vienkāršākā standarta izvēle vispārējām mācību nodarbībām. Tam nav vajadzīga ne liesma, ne fiksēšanas posms. Dažās augstskolu rokasgrāmatās izmantotais fiksētās uztriepes variants papildus paredz žāvēšanu gaisā un īsu termisko fiksēšanu, kā tas aprakstīts North Central Texas College vaiga uztriepes praktiskajā darbā, kas publicēts Biology LibreTexts, taču termiskā fiksēšana ir mikrobioloģijā ierasta prakse, nevis priekšnoteikums epitēlija šūnu saskatīšanai.

Nepieciešamais: tīri priekšmetstikliņi un segstikliņi, sterili vienreizlietojami paraugu ņemšanas tamponi (vēlamā izvēle) vai jauni plakani zobu bakstāmie, pilinātājpudele ar 0.5 līdz 1 procenta metilēnzilā ūdens šķīdumu, destilēts vai dejonizēts ūdens, susināmais papīrs, cimdi un saliktais mikroskops ar 100x un 400x kopējo palielinājumu.

1. Izskalojiet muti ar tīru ūdeni. Tas aizvāc ēdiena daļiņas, kas vēlāk intensīvi iekrāsojas un novērš uzmanību no šūnām.
2. Katrs skolēns ņem paraugu tikai no sava vaiga. Ar jaunu sterilu tamponu saudzīgi paberzējiet vaiga iekšpusi. Piespiediet, nevis skrāpējiet. Pārtrauciet, pirms rodas jebkāds diskomforts vai asiņošana.
3. Ritiniet tamponu pāri tīra priekšmetstikliņa vidusdaļai, izveidojot plānu slāni. Plāns slānis ir vissvarīgākais nosacījums skaidri saskatāmam preparātam. Biezs balts materiāla slānis iekrāsosies zilā masā, kurā neko nevarēs atšķirt.
4. Uzpiliniet uz uztriepes vienu metilēnzilā pilienu. Atstājiet uz 1 līdz 3 minūtēm. Daudzos augstskolu protokolos pietiek ar vienu minūti; NCERT IX klases dabaszinību laboratorijas rokasgrāmatā pagaidu preparātam paredzētas aptuveni 3 minūtes. Ilgāk nenozīmē labāk, un pārkrāsošana ir biežākā krāsošanas ilguma kļūda.
5. Saudzīgi noskalojiet ar destilētu ūdeni vai uzsūciet lieko krāsvielu ar susināmo papīru atbilstoši vietējam protokolam. Fonam jākļūst gaiši zilam, nevis tumši zilam.
6. Nolaidiet segstikliņu slīpi, lai vispirms pieskartos viena mala, un tad ļaujiet tam lēnām nolaisties. Tas novērš gaisa burbuļu veidošanos.
7. Sāciet ar mazu palielinājumu, lai atrastu šūnas, pārbaudiet fokusu un centrējumu, tad pārejiet uz 100x un visbeidzot 400x. Pie 400x izmantojiet tikai smalko fokusēšanu.

Par krāsvielas koncentrāciju jāpasaka viens precizējums. Skolu protokolos parasti izmanto aptuveni 1 procenta metilēnzilā ūdens šķīdumu. Koncentrētāks sākumšķīdums vai ilgāka iedarbība fonu padara tumšāku straujāk nekā kodolu, tādējādi apvēršot kontrastu, uz kuru balstās šis uzdevums.

Droša rīcība ar vaiga paraugiem

Vaiga paraugos ir siekalas un parastie mutes dobuma mikroorganismi, tāpēc katra svaiga uztriepe jāuzskata par potenciāli infekciozu materiālu, pat ja paraugu devēji ir veseli klasesbiedri. Amerikas Mikrobioloģijas biedrības biodrošības vadlīnijās mācību laboratorijām noteikti vispārējie principi: pirms nodarbības izvērtēt risku, valkāt cimdus, aizsargāt acis, ja iespējamas šļakatas, pēc darba nomazgāt rokas, dezinficēt darba virsmas un piesārņotos vienreizlietojamos piederumus likvidēt saskaņā ar apstiprināto bioloģisko atkritumu apsaimniekošanas kārtību.

Lielāko daļu risku palīdz novērst četri nodarbības noteikumi. Katrs tampons un priekšmetstikliņš paredzēts tikai vienam parauga devējam; tos nekad nedala ar citiem. Paraugu ņem tikai no sevis, nekad no blakussēdētāja. Vienreizlietojamos tamponus un zobu bakstāmos uzreiz izmet paredzētajā atkritumu tvertnē, nekad neliek atpakaļ uz galda. Pats metilēnzilais iekrāso ādu un apģērbu un kairina acis, tāpēc jālieto cimdi un jāievēro ierastā higiēna darbā ar krāsvielām. Nepaplašiniet šo uzdevumu, audzējot jebko no uztriepes, un neimprovizējiet ar svaiga cilvēka izcelsmes materiāla termisko fiksēšanu ārpus skolas drošības procedūras.

Ko novērot un kāpēc tas izskatās tieši tā

Pie 100x meklējiet platas, plakanas, gaiši zilas šūnas ar neregulārām ovālām vai daudzstūrainām kontūrām. Tās atrodas atsevišķi vai vaļīgos, savstarpēji pārklājošos slāņos. Katrā šūnā parasti ir viens tumšāk zils plankums. Tas ir kodols. Pievērsiet uzmanību arī izkārtojumam: plakanā epitēlija šūnas atgādina plānas flīzes, nevis lodes, tāpēc to malas izskatās drīzāk pēc saplaisājušas glazūras, nevis apaļiem baloniem.

Pie 400x skaidri izšķiramas trīs pazīmes. Šūnas robeža izskatās kā plāna, tumšāka līnija, kas apņem šūnu. Citoplazma aizpilda iekšpusi ar gaišu, vienmērīgu zilu krāsojumu. Kodols ir tumšāks un kompaktāks, bieži ovāls, parasti tuvu centram, bet ne vienmēr. Lūdziet skolēnus atzīmēt visas trīs pazīmes, kā arī formu un palielinājumu, jo darba lapā prasīts tieši tas.

Šeit svarīgs viens precizējums, ko daudzās darba lapās norāda nepareizi. Redzamā robeža atbilst plazmatiskās membrānas apvidum, taču pati membrāna — aptuveni 7 līdz 10 nanometrus biezs lipīdu dubultslānis — ir daudz plānāka, nekā skolas mikroskops spēj izšķirt. Skolēni redz šūnas optisko malu un tur uzkrājušos krāsvielu. Tā pati piesardzība attiecas uz organoīdiem. Mitohondriji, endoplazmatiskais tīkls, Goldži kompleksi un ribosomas šajā preparātā nav redzami. Parasts gaismas mikroskops labos apstākļos spēj izšķirt detaļas līdz aptuveni 0.2 mikrometriem, kā skaidrots NCBI šūnu bioloģijas pārskatā par mikroskopijas rīkiem, un lielākā daļa ultrastruktūras elementu ir mazāki par šo robežu vai tuvu tai. Lielāks tukšais palielinājums palielina attēlu, nepievienojot detaļas.

Kāpēc kodols iekrāsojas vistumšāk? Metilēnzilais ir katjoniska krāsviela, kas šķīdumā ir pozitīvi lādēta, un tā saistās ar negatīvi lādētām vielām šūnā, galvenokārt nukleīnskābēm. Hromatīnā kodolā ir koncentrēta DNS, tāpēc kodols uzkrāj visvairāk krāsvielas. Citoplazma satur RNS un citas lādētas molekulas, tāpēc arī tā iekrāsojas, taču izkliedētāk un gaišāk. Būtiska atruna: metilēnzilais nav DNS specifiska krāsviela. Pētījumā par metilēnzilā sadalījumu kodolu attēlveidošanā aprakstīta katjona saistīšanās ar nukleīnskābēm bagātiem apvidiem, savukārt senākā kvantitatīvā pētījumā par metilēnzilā saistīšanos šūnu preparātos konstatēts, ka lielākā daļa saistītās krāsvielas ir saistīta ar nukleīnskābēm. Tātad tumšs kodols un gaiša citoplazma ir kontrasta raksts, nevis molekulārs tests.

Skolēnu iespējamās kļūdas un to atpazīšana

Gandrīz katrs neveiksmīgais preparāts atbilst vienam no pieciem raksturīgiem gadījumiem. Māciet skolēniem noteikt preparāta problēmu, nevis akli atkārtot tā gatavošanu.

Pārkrāsojot šūnas un fons kļūst vienmērīgi tumši, tāpēc kodols saplūst ar redzes lauku. To novērš īsāks krāsošanas laiks vai rūpīgāka skalošana. Nepietiekama krāsošana atstāj blāvas ēnas, kas pazūd, palielinot apgaismojumu; pagariniet krāsošanu ar trīsdesmit sekunžu soli. Biezas uztriepes veido blīvas, savstarpēji pārklājošās masas, kurās nevar izsekot nevienai kontūrai; risinājums ir mehānisks — nākamreiz izklājiet plānāk, jo nekāda skalošana neglābs šūnu kaudzi. Gaisa burbuļi izskatās kā perfekti apļi ar asām, tumšām malām un novērš iesācēju uzmanību, jo tie tos sajauc ar struktūrām; uzlieciet segstikliņu vēlreiz, lēnām un slīpi. Sīki tumši punktiņi uz šūnām vai ap tām parasti ir normālās mutes dobuma baktērijas, kā norādīts tādos skolu protokolos kā Ingrid Science vaiga šūnu izpētes procedūra. Tie apliecina, ka mutē mīt mikroorganismi, kas skolēniem var palikt atmiņā, taču šajā uzdevumā nevar noteikt to sugu un tos nedrīkst zīmēt kā šūnas daļas. Ēdiena atliekas un gļotu pavedieni iekrāsojas nevienmērīgi un intensīvi; iepriekšēja mutes skalošana paredzēta to samazināšanai.

Ko ar šo uzdevumu nevar noteikt

Šis ir mācību novērojums, nevis diagnostisks tests. Šūnu izskats mācību nodarbībā krāsotā preparātā neļauj diagnosticēt infekciju, vēzi vai jebkādu slimību, un rakstu nevajadzētu uztvert kā norādi uz pretējo. Preparāts parāda formu, robežu, citoplazmu un kodolu divos palielinājumos. Tas neparāda membrānas ultrastruktūru, organoīdu detaļas vai molekulāro identitāti. Skaidra ierobežojumu norādīšana pasargā gan zinātnisko precizitāti, gan skolēnus: labs rezultāts ir pareizi apzīmēts zīmējums ar norādītu palielinājumu un krāsvielu, nevis secinājums par veselību.

Skolēna darba lapa un mikrogrāfijas ar apzīmējumiem

Divi šai lapai sagatavotie mācību materiāli ir iepriekš redzamā mikrogrāfija ar apzīmējumiem un tālāk redzamā darba lapa. Izdrukājiet katram skolēnam vienu darba lapu vai projicējiet to un lūdziet skolēniem pārzīmēt laukumus burtnīcās.

Kā to izmantot 45 minūšu nodarbībā: desmit minūtes drošības instruktāžai un paraugu ņemšanai, desmit minūtes krāsošanai un preparāta sagatavošanai, piecpadsmit minūtes novērošanai un skicēšanai abos palielinājumos, desmit minūtes pārbaudes sarakstam un salīdzināšanai ar mikrogrāfiju, kurā ir apzīmējumi. Pārbaudes saraksta punkti apzināti ir vienkārši un konkrēti. Plāna uztriepe, pareizs krāsošanas laiks, kodols tumšāks par citoplazmu, pierakstīts palielinājums. Skolēns, kurš var atzīmēt visus četrus, ir sapratis principu, ko paredzēts iemācīt šajā nodarbībā: mikroskopi parāda atšķirības, bet krāsvielas rada atšķirības, kuras ir vērts parādīt.