Reaktīvo skābekļa formu mērīšana eksperimentos ar metilēnzilo

Divas laboratorijas veic eksperimentus, kurus katra dēvē par metilēnzilā antioksidatīvās iedarbības eksperimentiem. Viena ziņo, ka krāsviela nomāc reaktīvās skābekļa formas. Otra ziņo, ka tā šīs formas rada. Abas uzrāda skaidras devas–atbildes reakcijas līknes. Abas rīkojas godprātīgi. Atšķirības cēlonis nav krāpšana vai nekompetence. Abas grupas dažādā apgaismojumā mērīja atšķirīgas parādības ar zondēm, kas atbild uz atšķirīgiem jautājumiem, un pēc tam abus rezultātus aprakstīja ar vienu un to pašu apzīmējumu: ROS.

Metilēnzilo ir grūti precīzi mērīt, jo tā molekula piedalās ķīmiskajos procesos, kurus tai būtu jāpalīdz novērot. Tumsā tas pārnes elektronus starp donoriem un akceptoriem un atgriežas sākotnējā formā, gatavs atkārtot ciklu. Gaismā tas kļūst par fotosensibilizatoru, sasniedzot ierosinātu tripleta stāvokli, no kura var nodot enerģiju skābeklim, veidojot singletā skābekļa molekulas, vai pārnest elektronus, veidojot radikāļus un ūdeņraža peroksīdu. Jebkuru šādā sistēmā ievietotu zondi pati krāsviela var oksidēt, reducēt, izbalināt vai optiski maskēt. Tāpēc jebkura ROS mērījuma pirmais jautājums nekad nav par iegūto skaitli. Vispirms jānoskaidro, ko tests patiesībā nosaka un kā krāsviela ietekmē pašu testu.

Amplex Red: kalibrēts ūdeņraža peroksīda tests

Metilēnzilā un Amplex Red kombinācija ir vislabāk pamatotā kombinācija šajā literatūrā, ja tests ir pareizi izveidots. Ķīmiskā reakcija ir specifiska: mārrutku peroksidāze izmanto ūdeņraža peroksīdu, lai oksidētu Amplex substrātu līdz fluorescējošam produktam — rezorufīnam — ar aptuveni viens pret vienu stehiometriju. Paraugā esošais peroksīds pārvēršas detektorā reģistrētā fluorescencē. Neviena cita ierastajai ROS grupai piederoša forma šo reakciju tieši neizraisa.

Izšķirošā priekšrocība ir kalibrēšana. Rūpīgs pētnieks analizē zināmas koncentrācijas peroksīda standartus tajā pašā buferšķīdumā, ar tādām pašām peroksidāzes un substrāta koncentrācijām, tādu pašu inkubācijas laiku un tiem pašiem optiskajiem iestatījumiem, un pēc tam salīdzina paraugu rādījumus ar iegūto līkni. Izolētu smadzeņu mitohondriju pētījumā, kas ir šīs metodes pamats, autori rīkojās tieši tā: katra mērījumu cikla beigās pievienoja zināmu peroksīda daudzumu, un rezultātus izteica kā ātrumu pikomolos minūtē uz miligramu proteīna, nevis patvaļīgās fluorescences vienībās. Tieši tas pārvērš spīdēšanu par mērījumu.

Trīs šī pētījuma detaļas ir vērts pārņemt. Pirmkārt, autori pārbaudīja signālu ar katalāzi, kas noārda peroksīdu. Metilēnzilā izraisītais fluorescences pieaugums apstājās, kad tika pievienota katalāze, apstiprinot, ka signālu radīja peroksīds, nevis optisks artefakts. Otrkārt, viņi tieši pārbaudīja apgaismojuma ietekmi, ar aizvaru ierobežojot ierosmes staru tā, lai paraugi saņemtu vienu astoto daļu no parastās gaismas devas, un signāls samazinājās tikai par deviņiem procentiem. Vairāk nekā deviņdesmit procenti no konstatētā peroksīda nebija atkarīgi no mērīšanai izmantotās gaismas. Treškārt, viņi ar elektrodu atsevišķi mērīja peroksīda elimināciju un konstatēja, ka krāsviela gan palielināja tā veidošanos, gan palēnināja noārdīšanu. Zonde, kas uzrāda tikai kopējo fluorescences izmaiņu, šīs divas ietekmes būtu sapludinājusi.

Testam joprojām ir vājās vietas, un metilēnzilais ietekmē vairākas no tām. Krāsviela absorbē plašā diapazonā tajā pašā spektra sarkanajā apgabalā, kurā rezorufīns izstaro gaismu, tāpēc augstā krāsvielas koncentrācijā paraugs iekšējā filtra efektu dēļ var maskēt pats savu signālu. Tāpēc standartos jābūt tādai pašai krāsvielas koncentrācijai kā paraugos. Arī pats Amplex Red var fotooksidēties, un tā produkts rezorufīns var iesaistīties fotoredoksa ciklos, kas rada superoksīdu un peroksīdu. Tas ir īpaši svarīgi, ja eksperimentā tiek apgaismots arī fotosensibilizators. Praktisks risinājums ir vispirms apstarot metilēnzilā paraugus un pēc tam to alikvotas analizēt ar Amplex reaģentiem tumsā, nevis apgaismot krāsvielu un zondi kopā. Visbeidzot, superoksīda dismutāze ne vienmēr nomāc Amplex signālu: superoksīda pārvēršana peroksīdā var to palielināt. SOD kontrole, kas palielina fluorescenci, nav neveiksmīga. Tā ir identificējusi superoksīdu kā reakciju ķēdes iepriekšējā posmā iesaistītu formu.

DCFDA: nespecifisks oksidēšanās indikators

Metilēnzilā un DCFDA kombinācija ir lielākās daļas neskaidrību avots. DCFH-DA ir prekursors, ko ievada šūnās. Esterāzes šūnas iekšienē atšķeļ tā acetātgrupas, atstājot nefluorescējošu DCFH, un DCFH oksidēšanās rada fluorescējošu DCF. To oksidē daudzas vielas: hidroksilradikāļi, peroksidāzes un hēma starpprodukti, slāpekļa dioksīds, hipohlorskābe un no peroksinitrīta atvasināti radikāļi. Ūdeņraža peroksīds viens pats to tieši neoksidē ar praktiski noderīgu ātrumu; no peroksīda atkarīgai fluorescencei parasti nepieciešama arī dzelzs, hēma proteīnu vai peroksidāzes reakciju iesaiste.

Kritiskais izvērtējums, uz kuru būtu jāatsaucas ikvienā metožu sadaļā, ir Kalyanaraman un kolēģu veiktā DCFH kā zondes analīze, kas apkopota smadzeņu mitohondriju pētījumā, kurā šī iemesla dēļ atteicās no DCFDA. Tajā parādīts, ka krāsviela reaģē lēni, ar nenoskaidrotu stehiometriju, bez derīgas kalibrēšanas un arī ar savienojumiem, kas nav ROS. Turklāt zonde pastiprina to, ko mēra: DCFH viena elektrona oksidēšanās rada DCF radikāli, kas reaģē ar skābekli, veidojot superoksīdu; tas savukārt dismutējas, radot papildu peroksīdu. Mērījums daļēji pats rada ķīmiskos procesus, par kuriem tas ziņo.

Tas viss nepadara DCFDA bezjēdzīgu. Tas nozīmē, ka tā ir skrīninga, nevis identifikācijas metode. DCF fluorescences pieaugums nozīmē, ka palielinājusies no oksidētājiem atkarīga zondes oksidēšanās. Tas nenozīmē, ka palielinājies peroksīda daudzums, un pavisam noteikti nenozīmē, ka palielinājies kopējais ROS daudzums — lielums, ko nemēra neviena atsevišķa zonde. Agrākos metilēnzilā pētījumos, kuros izmantoja DCF oksidēšanos pie koncentrācijām virs viena mikromola litrā, ziņoja par prooksidatīvu iedarbību, bet citās sistēmās tajā pašā laikposmā ziņoja par aizsardzību pret peroksīda izraisītu šūnu nāvi. Abi novērojumi var būt patiesi par vienu un to pašu krāsvielu atšķirīgos redoksa apstākļos, un DCF rezultāts viens pats nevar noteikt, kurš oksidētājs radīja signālu. Agrākā smadzeņu mitohondriju pētījuma nozīme ir tajā, ka šis skrīnings tika aizstāts ar kalibrētu peroksīda mērījumu un slodze tika noteikta tieši: pat simt nanomolu litrā krāsvielas koncentrācija vairākas reizes palielināja peroksīda izdalīšanos ar katru pārbaudīto substrātu un katrā pārbaudītajā elpošanas stāvoklī.

DCFDA ir vēl viena tieši metilēnzilajam raksturīga problēma. Krāsvielai ir intensīva krāsa un redoksa aktivitāte, tāpēc tā var izbalināt fluorescenci, dzēst emisiju vai oksidēt zondi neatkarīgi no šūnu ROS. Bezšūnu kontrole ar krāsvielu un zondi, bet bez šūnām, nav izvēles papildinājums. Tas ir eksperiments, kas parāda, vai krāsviela mijiedarbojas ar zondi.

Spinu uztveršana un skābekļa patēriņš: identitāte un plūsma

Fluorescences zondes parāda, ka ir parādījies kaut kas, kas spēj oksidēt zondi, savukārt elektronu spinu rezonanse ar spinu uztvērējiem sniedz daudz precīzāku priekšstatu par to, kas tas ir. Klasiskajā metilēnzilā fotoķīmijas pētījumā izmantoja ESR, lai noteiktu askorbāta radikāli krāsvielas, askorbāta un gaismas sistēmā, pēc tam skābekļa patēriņa eksperimentos parādīja peroksīda veidošanos un spinu uztveršanas eksperimentos — dzelzs katalizētu hidroksilradikāļu veidošanos. Katra metode atbildēja uz jautājumu, uz kuru pārējās nevarēja atbildēt: ESR noteica radikāļa identitāti, skābekļa patēriņš parādīja reakcijas plūsmu neatkarīgi no jebkādas fluorescences zondes, un metožu kombinācija parādīja, ka vienā apgaismotā sistēmā darbojas gan singletā skābekļa, gan radikāļu reakciju ceļi.

Šis 1984. gada rezultāts joprojām izklausās pēc brīdinājuma. Apgaismojuma un reducētāja klātbūtnē krāsviela radīja peroksīdu, bet dzelzs klātbūtnē sistēma veidoja hidroksilradikāli — visreaktīvāko no aplūkotajām formām. Autori to saistīja ar askorbātu acī un apšaubīja nepārdomātu lietošanu oftalmoloģijā. Mūsdienu lasītājiem jāņem vērā apstākļi: gaisma kopā ar reducētāju un dzelzi. Izslēdzot kaut vienu no šiem faktoriem, reakcijas ceļš vājinās vai izzūd.

Skābekļa elektrodi savu vērtību pierāda citādi. Klārka tipa elektrods mēra neto skābekļa patēriņu, kas apliecina, ka krāsvielas izraisītajās redoksa reakcijās tiek patērēts molekulārais skābeklis, un sniedz kinētikas datus, kurus nevar viltot neviens fluorescences artefakts. Tas neidentificē produktu. Peroksīda, superoksīda un ūdens veidošanās, kā arī singletā skābekļa sabrukšana ir procesi, kas patērē skābekli. Plūsma bez identitātes ir tikpat nepilnīgs raksturojums kā identitāte bez plūsmas, tāpēc labi pamatotos pētījumos elektrodu izmanto kopā ar kalibrētu peroksīda testu vai uztvērēju.

Kāpēc rezultāti par antioksidatīvo iedarbību ir pretrunīgi

Salīdzinot šos trīs mērījumu veidus, šķietamās pretrunas metilēnzilā literatūrā izskaidrojas ar metožu atšķirībām un trim bioloģiskiem faktiem.

Pirmkārt, krāsviela ir gan elektronu pārnesējs, gan peroksīda avots. Novirzot elektronus no elpošanas ķēdes vietām, kur skābeklis citādi kļūtu par superoksīdu, tā var samazināt vienas ROS daudzumu, kamēr tās reducētā forma tieši reducē skābekli līdz peroksīdam, palielinot citas ROS daudzumu. Tāpēc laboratorijai, kas pēta mitohondriju redoksa ķīmiju un metilēnzilā lomu apvedceļa nodrošināšanā, būtu jārēķinās ar rezultātiem, kas atkarīgi no zondes: vienā un tajā pašā kivetē pret superoksīdu jutīgas zondes rādījums samazinās, kamēr peroksīda rādījums pieaug.

Otrkārt, peroksīds mazās devās ir signāls, nevis tikai bojājumu avots. Peļu smadzeņu mitohondriju pētījumā, kas turpināja agrāko darbu, konstatēja peroksīda veidošanos jau pie piecdesmit nanomolu litrā krāsvielas koncentrācijas bez mitohondriju DNS bojājumiem terapeitiskajos līmeņos, kā arī aizsardzību pret rotenona izraisītiem bojājumiem pēc iepriekšējas apstrādes. Tikai pie simt mikromolu litrā koncentrācijas, kas ievērojami pārsniedz terapeitisko diapazonu, krāsviela bojāja atsevišķus DNS fragmentus, bet sarkanā gaisma kopā ar divdesmit mikromolu litrā krāsvielas koncentrāciju radīja singletā skābekļa molekulas, kas bojāja visus pārbaudītos fragmentus. Ierosinātais mehānisms ir hormētisks: neliela peroksīda veidošanās aktivē ar Nrf2 saistītās antioksidatīvās aizsardzības sistēmas un mitohondriju bioģenēzi, tāpēc īstermiņa prooksidatīvs rādījums parādās pirms ilgtermiņa antioksidatīva rezultāta. Testa rezultāti pēc vienas stundas un pēc vienas dienas var nesakrist, jo starplaikā ir mainījušies bioloģiskie procesi.

Treškārt, gaisma nosaka pat to, kura molekula ir klātesoša. Apgaismojums demetilē krāsvielu, veidojot Azure B un radniecīgus produktus, un pat mikroskopa lampa virs trauka ir pietiekama, lai izraisītu fotosensibilizāciju. Eksperimenti tumsā un apgaismojumā ir atšķirīgi eksperimenti, un jebkura protokola sadaļā par apgaismojuma un darba ar krāsvielu kontrolēm tie attiecīgi jānošķir.

Minimālais kontroles pārbaužu kopums un apgalvojumu izvērtēšana

Tālāk sniegtais salīdzinājums ir šim rakstam izveidots oriģināls uzziņas materiāls. Pirms pieņemat jebkuru metilēnzilā ROS rezultātu, pārbaudiet, kuras tabulas rindas autori ir izpildījuši un kuras izlaiduši.

No tā izriet praktisks interpretācijas noteikums. Kalibrēts Amplex tests ar peroksidāzi un katalāzes pārbaudi sniedz pierādījumus par peroksīdu. DCFDA sniedz pierādījumus par nespecifisku zondes oksidēšanos un neko vairāk. Spinu uztveršana ar radikāļu uztvērēju kontrolēm sniedz pierādījumus par radikāļa identitāti. Skābekļa patēriņš sniedz pierādījumus par plūsmu. Teikums, kurā apgalvots vairāk, nekā izmantotais tests var pamatot, lai cik pārliecinoši tas būtu uzrakstīts, ir teikums par zondi, nevis par krāsvielu. Saistītie apskati par atkarību no devas un hormētisko diapazonu, mitohondriju elektronu plūsmu, testu interferenci krāsotos paraugos un mikroskopijas apgaismojuma artefaktiem papildina katru no šiem punktiem, un katrs punkts paliek spēkā arī pēc tam, kad tā viettura atsauce ir aizstāta.