Metilēnzilais un slāpekļa monoksīds: NOS, cGMP un asinsvadu signalizācija

Jautājums šķiet vienkāršs: vai metilēnzilais inhibē slāpekļa monoksīdu? Laboratorijā atbilde sadalās četros atsevišķos jautājumos, un katram ir vajadzīga cita eksperimentāla pārbaude. To sajaukšana ir galvenais iemesls, kāpēc teksti par metilēnzilo un slāpekļa monoksīdu izklausās pārliecinoši, bet neskaidri.

Iztēlojieties slāpekļa monoksīda signālu kā ķēdi ar četriem posmiem. Gēns tiek transkribēts, lai veidotos slāpekļa monoksīda sintāze. Enzīms pārvērš arginīnu slāpekļa monoksīdā. Gāze difūzijas ceļā sasniedz savu mērķi, pirms reaģē ar ko citu. Šķīstošā guanilātciklāze to uztver un veido ciklisko GMP. Par metilēnzilā ietekmi uz katru no šiem posmiem ir publicēti dati, taču pierādījumi iegūti atšķirīgās eksperimentālās sistēmās, dažādās koncentrācijās un ar dažādām izoformām. Rezultāts vienā posmā nepierāda iedarbību citā.

Kanoniskā ķēde vienkāršā izklāstā

Asinsvada sienā standarta secība ir šāda. Stimuls iedarbojas uz endotēlija šūnu. Endotēlija slāpekļa monoksīda sintāze, ko sauc par eNOS vai NOS3, rada nelielu slāpekļa monoksīda impulsu. Gāze difundē blakus esošajā gludās muskulatūras šūnā, saistās ar šķīstošās guanilātciklāzes hēmu, kura dzelzs ir reducētā stāvoklī, un paātrina GTP pārvēršanu cikliskajā GMP. Cikliskais GMP aktivē proteīnkināzi G, mainās kalcija regulācija, un muskulis atslābst.

Ir vēl viena ķēde, kuru svarīgi aplūkot atsevišķi. Infekcijas laikā vai citokīnu ietekmē šūnas transkribē cita enzīma gēnu — inducējamās slāpekļa monoksīda sintāzes jeb iNOS, ko sauc arī par NOS2. Tā rada lielākas un ilgstošākas slāpekļa monoksīda plūsmas nekā eNOS. Trešā izoforma, neironālā NOS jeb nNOS, darbojas vēl citā kontekstā. Ja publikācijā minēta slāpekļa monoksīda sintāze, nenorādot izoformu, apstājieties un pārbaudiet, kura tika mērīta. Pārskats par to, kā metilēnzilais pārnes elektronus, uzsver to pašu attiecībā uz oksidēšanās–reducēšanās mērķiem kopumā: pārneses posms pats par sevi neko nedara, un partneris katrā galā nosaka iznākumu.

Arī izmērītais cikliskais GMP ir integrēts rādītājs, nevis tieša enzīma aktivitātes analīze. Tā līmenis atspoguļo ciklāzes veikto sintēzi, no kuras atņemta fosfodiesterāžu izraisītā noārdīšana; asinsvadu gludajā muskulatūrā īpaši nozīmīga ir PDE5. Tāpēc cikliskā GMP samazinājums nozīmē, ka detektoru sasniedza vājāks signāls. Tas pats par sevi nenorāda, kurš posms nedarbojās.

1. posms: veidojas mazāk iNOS enzīma

Peļu makrofāgos, kas stimulēti ar baktēriju lipopolisaharīdu, gamma interferonu vai abiem, metilēnzilais novērsa paredzamo iNOS proteīna daudzuma pieaugumu un ievērojami samazināja iNOS matrices RNS daudzumu makrofāgu transkripcijas eksperimentos. Informatīvi ir tieši tas, kas nemainījās. Inhibitora I kappa B alfa noārdīšanās, NF kappa B un STAT1 fosforilēšanās un šo faktoru pārvietošanās uz kodolu lielākoties saglabājās neskarta. Samazinājās to saistīšanās ar DNS, ko apstiprināja hromatīna imūnprecipitācija, uzrādot mazāku šo faktoru piesaisti iNOS promotoram.

Tā ir gēnu regulācijas ietekme, kas notiek pirms enzīma daudzuma izmaiņām, nevis jau esoša enzīma akūta bloķēšana. Tā attiecas uz iekaisuma signalizāciju, kur transkripcijas faktoriem jāpiesaistās promotoram, pirms parādās proteīns. Tā neko tieši nepasaka par konstitutīvo eNOS asinsvadā miera stāvoklī, un arī aprakstam šī robeža jāievēro.

2. posms: esošais NOS enzīms darbojas lēnāk

Pētījumā ar žurkām tika pārbaudīts cits līmenis. Pie samaņas esošiem žurku tēviņiem intravenozi ievadīja lipopolisaharīdu, pēc tam trīs stundas vēlāk intravenozi ievadīja vai nu fizioloģisko šķīdumu, vai metilēnzilo 3 mg uz kg, un slāpekļa monoksīda sintāzes aktivitāti hipotalāma mediālajā bazālajā daļā noteica pēc iezīmēta arginīna pārvēršanās citrulīnā hipotalāma NOS aktivitātes pētījumā. Stress kopā tikai ar fizioloģisko šķīdumu izraisīja zināmu no kalcija neatkarīgu aktivitāti, bet lipopolisaharīds to palielināja līdz aptuveni desmitkārtīgam kontroles līmenim. Metilēnzilais likvidēja abus inducētos komponentus. No kalcija atkarīgā konstitutīvā aktivitāte šajos audos pie attiecīgās devas un mērījuma laika nemainījās.

Lasiet šo rezultātu tieši tā, kā tas formulēts: attiecīgajos apstākļos tika nomākta izmērītā iNOS tipa aktivitāte. Tas nav gēnu ekspresijas mērījums un nepierāda nemainīgu selektivitāti pret iNOS salīdzinājumā ar eNOS vai nNOS. Darbs ar attīrītiem enzīmiem vēl vairāk uzsver piesardzības nepieciešamību. Tiešās attīrītas slāpekļa monoksīda sintāzes analīzēs metilēnzilais pilnībā bloķēja citrulīna veidošanos pie 30 mikromolāras koncentrācijas; koncentrācija, kas izraisīja pusi no maksimālās inhibīcijas, bija aptuveni 5.3 mikromolāri bez superoksīda dismutāzes un 9.2 mikromolāri tās klātbūtnē, kā ziņots attīrītas NOS un guanilātciklāzes salīdzinājumā. Atsevišķā attīrītas nNOS pētījumā tika norādīts uz enzīmam piesaistītā hēma oksidēšanos. Praktiskais secinājums ir tāds, ka tieša NOS inhibīcija izolētās sistēmās patiešām notiek, taču hipotalāma rezultātu nevar paplašināt līdz vispārīgam apgalvojumam, ka metilēnzilais visur atstāj neskartas visas konstitutīvās NOS.

3. posms: slāpekļa monoksīds zūd, pirms sasniedz mērķi

Visskaidrākais pierādījums tam, ka cikliskā GMP samazinājumu var izskaidrot kas cits, nevis enzīma bloķēšana, iegūts kultivētās truša plaušu artērijas gludās muskulatūras šūnās. Eksperimenta uzbūve pilnībā apgāja endogēno NOS, tieši pievienojot slāpekļa monoksīda donorus, un pēc tam pārbaudot, vai metilēnzilais joprojām nomāc cikliskā GMP atbildes reakciju asinsvadu gludās muskulatūras superoksīda pētījumā.

Tika pārbaudīti trīs donori koncentrācijās no 1 līdz 100 mikromolāriem: S-nitrozo-L-cisteīns, nātrija nitroprusīds un stabils deaminēts analogs ar nosaukumu MPANO. Visi palielināja cikliskā GMP līmeni aptuveni 1.5 līdz 12 reizes. Metilēnzilais 10 mikromolārā koncentrācijā inhibēja pirmo divu donoru atbildes reakciju par 51 līdz 100 procentiem, bet MPANO atbildes reakciju nemainīja. Ja metilēnzilais vienkārši bloķētu ciklāzes katalītisko centru, šādu selektivitāti pret donoriem būtu grūti izskaidrot, jo visi trīs iedarbojas uz vienu un to pašu pakārtoto enzīmu.

Pēc tam trīs kontroles ļāva sasaistīt mehānismu ar superoksīdu. Pirmkārt, ārpusšūnu superoksīda veidošana ar ksantīnu un ksantīna oksidāzi atkārtoja to pašu ainu: CYSNO un nitroprusīda iedarbība tika bloķēta, bet MPANO iedarbība saglabājās. Otrkārt, metilēnzilais izraisīja no devas un laika atkarīgu superoksīda veidošanos gludās muskulatūras šūnās, ko mērīja pēc citohroma c reducēšanās. Treškārt, superoksīda dismutāze pilnībā novērsa inhibīciju, bet katalāze to nenovērsa, norādot, ka šajā eksperimentālajā sistēmā tiešais iedarbības izraisītājs bija superoksīds, nevis ūdeņraža peroksīds.

Ir vērts aprakstīt eksperimenta kopkultūras variantu, jo tas parāda iedarbības vietu telpā. Endotēlija šūnas uz segstikliņiem īslaicīgi kultivēja kopā ar gludās muskulatūras šūnām, tādējādi bazāli izdalītais endotēlija faktors palielināja cikliskā GMP līmeni gludajā muskulatūrā trīs līdz astoņas reizes. Iepriekšēja apstrāde ar metilēnzilo jebkurā no abiem šūnu nodalījumiem samazināja šo signālu, un superoksīda dismutāze daļēji novērsa endotēlija iepriekšējās apstrādes ietekmi. Citiem vārdiem, metilēnzilajam nemaz nav obligāti jādarbojas gludās muskulatūras šūnā, kas uztver signālu. Tas var vājināt signālu, likvidējot signālmolekulu ceļā uz mērķi. Metilēnzilā pētījumu lasīšanas ceļvedis to aplūko kā vispārīgu noteikumu: pirms molekulārā mērķa nosaukšanas norādiet nodalījumu, kurā veikta iejaukšanās.

Nosaukt to par NOS inhibīciju būtu nepareizi. Donoru darbībai nebija vajadzīgs sintāzes posms, tomēr signāls tik un tā samazinājās.

4. posms: pats detektors reaģē vājāk

Tieša ietekme uz šķīstošo guanilātciklāzi pastāv, taču koncentrācijām ir nozīme. Iepriekš minētajā attīrīto enzīmu salīdzinājumā slāpekļa monoksīda stimulētai ciklāzei pusei no maksimālās inhibīcijas bija vajadzīgi aptuveni 60 mikromolāri metilēnzilā, savukārt NOS attiecīgā koncentrācija bija aptuveni 5 līdz 9 mikromolāri, un pat 1 milimolāra koncentrācija radīja tikai daļēju maksimālo blokādi. Tā ir aptuveni sešas līdz vienpadsmit reizes liela atšķirība. Tāpēc šūnu eksperimentu ar zemu mikromolāru koncentrāciju, kurā samazinās cikliskais GMP, nevar raksturot kā selektīvu ciklāzes inhibīciju, balstoties tikai uz cikliskā GMP vērtību.

Vēlāks oksidēšanās–reducēšanās pētījums pievienoja vēl vienu iemeslu piesardzībai: metilēnzilais deaktivēja slāpekļa monoksīda aktivētu ciklāzi ar mehānismu, kas atšķīrās no vienkāršas hēma dzelzs oksidēšanās gaisa ietekmē. Tātad detektora darbība var tikt traucēta, taču ķīmiskais mehānisms nav līdz galam noskaidrots, un koncentrāciju atšķirība nozīmē, ka pie zemām mikromolārām koncentrācijām vispirms jāizslēdz superoksīda un NOS ietekme. Šeit ir vieta arī fosfodiesterāžu kontrolei. Ja vien noārdīšanās nav izmērīta vai bloķēta, mazāka cikliskā GMP uzkrāšanās var atbilst mazākai sintēzei, ātrākai noārdīšanai vai abiem.

Kāpēc to nevar reducēt uz vienu apgalvojumu par asinsspiedienu

Katrs posms tika pierādīts atšķirīgā sistēmā. Transkripcija makrofāgos nav enzīma aktivitāte hipotalāmā. Hipotalāma aktivitāte pēc lipopolisaharīda ievadīšanas nav endotēlija uzturētais tonuss miera stāvoklī. Bazāli izdalītais endotēlija faktors kopkultūrā nav agonista stimulēta vazodilatācija. Kultivētas plaušu artērijas šūnas 10 mikromolāra metilēnzilā klātbūtnē nav cilvēka asinsrite. Apvienojot to visu apgalvojumā, piemēram, ka metilēnzilais paaugstina asinsspiedienu, bloķējot slāpekļa monoksīdu, tiek atmestas tieši tās atšķirības, kuru saglabāšanai bija paredzētas kontroles.

Trīs pārbaudes palīdz saglabāt izklāsta precizitāti. Pirmkārt, nosauciet izoformu: eNOS asinsvadu tonusam miera stāvoklī, iNOS inducētai iekaisuma plūsmai un nNOS neironālajos un dažos attīrītu enzīmu pētījumu kontekstos. Otrkārt, norādiet slāpekļa monoksīda signāla avotu: endogēna sintēze, bazāla izdalīšanās no endotēlija vai konkrēts donors, piemēram, CYSNO, nitroprusīds vai MPANO, jo stabilais donors bija noturīgs pret metilēnzilā iedarbību, bet labilie donori nebija. Treškārt, norādiet koncentrāciju un to, kas atjaunoja atbildes reakciju: superoksīda dismutāzes izraisīta atjaunošanās norāda uz superoksīda iesaisti, katalāzes efekta trūkums šajā eksperimentālajā sistēmā liecina pret ūdeņraža peroksīda iesaisti, ksantīna oksidāzes spēja atkārtot iedarbību parāda šā mehānisma pietiekamību, un attīrītu enzīmu analīzes nošķir tiešu ietekmi uz katalīzi no signāla zuduma ceļā uz mērķi.

Īss kopsavilkums ir šāds. Metilēnzilo labāk uztvert kā vielu, kas vairākos posmos traucē slāpekļa monoksīda–cikliskā GMP signalizāciju, nevis kā selektīvu ciklāzes bloķētāju. Atkarībā no eksperimentālās sistēmas un koncentrācijas tas var samazināt iNOS transkripcijas faktoru saistīšanos, tieši inhibēt NOS enzīmus, mazināt slāpekļa monoksīda pieejamību, veicinot superoksīda veidošanos, un traucēt slāpekļa monoksīda aktivētas ciklāzes darbību. Raksti par cikliskā GMP signalizācijas lomu asinsvadu pētījumos un šūnu analīzēs izmantoto slāpekļa monoksīda donoru salīdzinājumu katrs detalizētāk aplūko vienu no šiem atzariem, bet raksts par metodēm, ar kurām nošķir oksidēšanās–reducēšanās ietekmi no ietekmes uz enzīmiem skaidro, kāpēc šajā literatūrā tik bieži parādās superoksīda dismutāze kopā ar katalāzi un stabila donora kontroli.

Zema cikliskā GMP vērtība pēc metilēnzilā iedarbības norāda uz pārrautu ķēdi. Tikai kontroles parāda, kurš posms pārtrūka.