Metilēnzilais un neirotransmiteri: serotonīns, dopamīns, GABA un acetilholīns

Bieži sastopams apgalvojums par metilēnzilo vēsta, ka tas vienlaikus paaugstina serotonīna un dopamīna līmeni, nomierina GABA sistēmu un pastiprina acetilholīna darbību. Šis apgalvojums četrus atsevišķus laboratorijas atklājumus pasniedz kā vienotu ietekmi cilvēka organismā. Pētījumos, uz kuriem tas balstās, tika mērīti dažādi mērķi dažādos eksperimentālos preparātos, izmantojot koncentrācijas, kas atšķiras aptuveni tūkstoškārtīgi. Aplūkojot mērķus atsevišķi, aina kļūst gan interesantāka, gan piesardzīgāka, nekā ļauj šis viens teikums.

Pamatdoma ir vienkārša. Molekula, kas mēģenē saistās ar enzīmu, ir izdarījusi vienu lietu: saistījusies ar enzīmu mēģenē. Tas, vai šāda saistīšanās maina neirotransmitera līmeni dzīvās smadzenēs, ir atkarīgs no koncentrācijas, kas sasniedz audus, no molekulas ķīmiskās formas nonākšanas brīdī un no visa pārējā, ko molekula dara tajā pašā koncentrācijā. Katrā turpmākajā sadaļā šie trīs jautājumi tiek aplūkoti saistībā ar attiecīgo atklājumu.

Serotonīns: divi mērķi, divas koncentrācijas

No četrām sistēmām tieši par serotonīnu ir vispārliecinošākie pierādījumi, un tie attiecas uz diviem atšķirīgiem molekulāriem mērķiem, kurus nevajadzētu apvienot.

Pirmais mērķis ir A tipa monoamīnoksidāze — mitohondriju enzīms, kas noārda serotonīnu. Metilēnzilais inhibē attīrītu cilvēka MAO-A kā cieši saistošs inhibitors ar Ki aptuveni 27 nanomoli, savukārt MAO-B ietekmēšanai vajadzīgas daudz augstākas koncentrācijas, kā parādīts kinētikas pētījumā, kas saistīja šo krāsvielu ar serotonīna toksicitāti. Saistītā pētījumu virzienā tāda pati selektivitāte tika konstatēta žurku epifīzes audos: MAO-A bloķēšana palielināja no serotonīna atvasināto indolu daudzumu, samazināja serotonīna metabolīta 5-HIAA daudzumu un mainīja ar serotonīnu saistītu ķermeņa iztaisnošanās refleksu vardēm, kā ziņots pētījumā par oksidēšanās–reducēšanās krāsvielām un epifīzes indoliem. Divi atšķirīgi preparāti, viens un tas pats virziens: mazāka noārdīšanās un vairāk saglabāta serotonīna tur, kur enzīms to būtu noārdījis.

Otrais mērķis ir pats serotonīna transportieris. Šūnās, kas ekspresē cilvēka transportieri, metilēnzilais samazināja gan fluorescējoša substrāta, gan marķēta serotonīna uzņemšanu ar IC50 aptuveni 1.4 mikromoli un nomāca serotonīna izraisītās strāvas membrānas fragmenta sprieguma fiksācijas ierakstos, kā norādīts pētījumā, kas tieši raksturoja metilēnzilā iedarbību uz SERT. Autori pārbaudīja acīmredzamos alternatīvos skaidrojumus un konstatēja, ka ietekme nav atkarīga no cGMP signālu pārneses, kalcija izmaiņām vai transportiera ekspresijas uz šūnu virsmas.

Ievērojiet atšķirību starp šiem diviem skaitļiem. MAO-A inhibēšana notiek nanomolārās koncentrācijās. Transportiera inhibēšanai vajag aptuveni piecdesmit reižu vairāk krāsvielas. Zema ekspozīcija, kas pilnībā iedarbojas uz enzīmu, transportieri var ietekmēt pavisam nedaudz. Apvienojot šos rezultātus vienā apgalvojumā par serotonīnu, divi atšķirīgi devu diapazoni tiek sapludināti vienā.

Tas, vai kāds no šiem mērķiem ir nozīmīgs cilvēkam, kurš lieto citas serotonīnerģiskas zāles, ir jautājums par medikamentiem, un tas aplūkots zāļu mijiedarbības ceļvedī. Šis raksts kartē mērķus; minētā lapa sniedz klīniskos ieteikumus.

Dopamīns: visvājākie tiešie pierādījumi

Dopamīna gadījumā godīgs izklāsts prasa vislielāko piesardzību. Nav pārliecinoši nostiprināta pētījuma, kas parādītu, ka metilēnzilais bloķē dopamīna transportieri vai tieši saistās ar dopamīna receptoriem. Bieži citētā transportiera IC50 vērtība 1.4 mikromoli attiecas uz serotonīna transportieri, nevis DAT, un to nekad nedrīkst piedēvēt citam mērķim.

Pieejamie pierādījumi ir netieši. Tā kā MAO enzīmi metabolizē arī dopamīnu, MAO inhibēšana līdztekus serotonīnam un noradrenalīnam saglabā arī dopamīnu. Mitohondriju preparātos metilēnzilais bloķēja MAO-B mediēto neirotoksīna MPTP pārvēršanos par dopamīnerģisko sistēmu bojājošu toksīnu ar iedarbības stiprumu, kas bija salīdzināms ar Parkinsona slimības ārstēšanā lietoto deprenilu, kā aprakstīts MPTP bioaktivācijas pētījumā un saistītos darbos par MAO-B. Pētījumi ar dzīvniekiem papildina ainu ar atsevišķiem fragmentiem: aptuveni trīskāršs dopamīna bazālās izdalīšanās pieaugums no žurku striatuma šķēlēm pie 10 mikromolu koncentrācijas, kas pētīts slāpekļa monoksīda signālu pārneses kontekstā, nevis kā transportiera bloķēšana, un nevienādi rezultāti dažādos reģionos pēc sistēmiskas ievadīšanas; dažos pētījumos serotonīna un noradrenalīna līmenis paaugstinājās, bet dopamīna līmenis gandrīz nemainījās.

Tātad stāsts par dopamīnu ir reāls, taču netiešs. Tas saistīts ar enzīmu, kas vienlaikus apstrādā vairākus monoamīnus, nevis ar dopamīnam specifisku iedarbības punktu. Jebkurš apgalvojums, ka metilēnzilais cilvēkiem paaugstina dopamīna līmeni, izlaiž posmu, kurā tas būtu faktiski pierādīts.

GABA: bremzes bloķēšana saistīšanās kabatā

Atklājums par GABA ir precīzs un nesaskan ar krāsvielas reputāciju. Šūnās, kas ekspresē cilvēka GABA-A receptorus, metilēnzilais inhibēja GABA izraisītās strāvas, sākot aptuveni no 3 mikromolu koncentrācijas, ar IC50 tuvu 31 mikromolam izplatītajā alpha1-beta2-gamma2 konfigurācijā, kā parādīts elektrofizioloģijas pētījumā, kurā noteikta iedarbības vieta.

Vērtīgākā daļa ir iedarbības vietas noteikšana. Mutācijas pikrotoksīna saistīšanās vietā nemainīja inhibēšanu, savukārt benzodiazepīnu un cinka saistīšanās vietas tika izslēgtas, salīdzinot receptoru apakšvienības. Turpretī mutācijas divās aminoskābju atliekās, par kurām zināms, ka tās veido pašu GABA saistīšanās kabatu, krasi samazināja bloķēšanu. Tas norāda uz konkurējošu antagonismu agonista saistīšanās vietā, nevis uz allostērisku modulāciju citur. Ietekme saglabājās dažādās sinaptisko un ekstrasinaptisko apakšvienību kombinācijās un ātri izzuda pēc vielas izskalošanas.

Tas rada patiesu pretrunu, ko vērts skaidri nosaukt. Molekula, ko pēta atmiņas atbalstam, eksperimentālā traukā arī nomāc ātro inhibējošo signālu pārnesi. Tas, vai šāda nomākšana notiek dzīvās smadzenēs, ir atkarīgs no vietējās koncentrācijas, un 31 mikromols ir augsta koncentrācija salīdzinājumā ar lielāko daļu sistēmiskās ekspozīcijas līmeņu, kas aplūkoti noslēdzošajā sadaļā. Pati pretruna ir šis atklājums; tās atrisināšanai būtu vajadzīgi eksperimenti, kurus neviens vēl nav veicis.

Acetilholīns: divi pretēji iedarbības punkti

Par acetilholīnu ir divi atklājumi, kas darbojas pretējos virzienos, un tieši tāpēc tie jāapraksta atsevišķi.

No vienas puses, metilēnzilais inhibē enzīmus, kas noārda acetilholīnu. Govju eritrocītu acetilholīnesterāze tika konkurējoši inhibēta aptuveni pie 0.57 mikromolu koncentrācijas, liellopu enzīms — pie aptuveni 0.42 mikromolu koncentrācijas, bet cilvēka plazmas esterāzes aktivitāte — pie aptuveni 1.1 mikromola koncentrācijas. Butirilholīnesterāze tika inhibēta aptuveni 0.4 līdz 5.3 mikromolu diapazonā atkarībā no sugas un preparāta, kā apkopots pārskatā par metilēnzilā iedarbību nervu sistēmā. Palēninot noārdīšanu, sinapsē paliek vairāk neirotransmitera — tā pati loģika ir vairāku apstiprinātu Alcheimera slimības zāļu pamatā.

Taču šai ķīmiskajai iedarbībai ir nosacījums. Oksidētā zilā forma inhibē enzīmu; reducētā bezkrāsainā forma to nedara. Ilgstošos inkubācijas eksperimentos, kuros krāsviela var reducēties, jau šā iemesla dēļ vien tiek novērota vājāka inhibēšana. Jebkurai holīnesterāzes testa skaitliskajai vērtībai ir neredzams mainīgais: cik liela krāsvielas daļa mērījuma brīdī vēl bija zilā formā.

No otras puses, metilēnzilais bloķē alpha7 nikotīnisko receptoru — vienu no receptoriem, uz kuriem iedarbojas acetilholīns. Varžu oocītos ekspresēti cilvēka alpha7 receptori tika inhibēti ar IC50 tuvu 3.4 mikromoliem, izmantojot nekonkurējošu, no sprieguma neatkarīgu antagonismu, kas nemainīja agonista iedarbības stiprumu. Savukārt 3 mikromolu koncentrācija pilnībā novērsa holīna izraisītās sinaptiskās atbildes žurku hipokampa šķēlēs, kā ziņots alpha7 receptoru pētījumā. Tātad līdzīgās zemās mikromolārās koncentrācijās krāsviela gan saglabā neirotransmiteru, gan vājina viena tā receptora darbību. Kopējo ietekmi uz holīnerģisko signālu pārnesi nevar izsecināt no kāda no šiem atklājumiem atsevišķi. Šī nenoteiktība sasaucas ar plašāku literatūru par Alcheimera slimību un ar saistīto diskusiju par kognitīvo funkciju un slimību pētījumiem, taču šeit tā netiek atrisināta.

Salīdzinājums vienuviet

Visjutīgāko mērķi no vismazāk jutīgā šķir trīs lieluma kārtas. Šī atšķirība ir viss raksts vienā tabulā.

Vai šīs koncentrācijas tiek sasniegtas smadzenēs?

Skaitlis no mēģenes neko neizsaka, ja blakus nav ekspozīcijas rādītāja. Pēc intravenozas bolusdevas aptuveni 1.4 mg uz kg ir ziņots par vidējo līmeni cilvēka plazmā ap 5 mikromoliem, savukārt 100 mg perorāla deva tā paša literatūras kopuma datos radīja līmeni pilnasinīs ap 0.08 mikromoliem. Izkliedes pētījumos ar žurkām konstatēts, ka līmenis smadzenēs ir aptuveni desmit līdz divdesmit reižu augstāks nekā cirkulācijā, lai gan tas ir kopējais krāsvielas daudzums homogenizētos audos, nevis brīvā oksidētā krāsviela sinapsē. Turklāt saistīšanās ar plazmas olbaltumvielām aptuveni 94 procentu apmērā un sadalījums asins šūnās vēl vairāk samazina brīvo frakciju.

Salīdzinot ar tabulu, aina ir pakāpeniska, nevis vienkārša «jā vai nē». MAO-A inhibēšanas koncentrācija ir daudz zemāka par tipisko intravenozās ekspozīcijas līmeni, tāpēc šāda inhibēšana ir farmakoloģiski ticama, kad krāsviela tiek ievadīta šādi. Ietekme uz holīnesterāzi un alpha7 atrodas zemajā mikromolārajā diapazonā, ar kuru pārklājas intravenozas ievadīšanas maksimālās koncentrācijas, bet kuru parastas perorālas devas var nesasniegt. GABA-A IC50 — 31 mikromols — pārsniedz lielāko daļu ticamo sistēmiskās ekspozīcijas līmeņu, tāpēc tieši šo bloķēšanu ir visgrūtāk attiecināt uz cilvēka organismu kopumā. Katrai šā salīdzinājuma rindai vajadzīga viena un tā pati atruna: nozīmīga ir brīvās, oksidētās, ārpusšūnu krāsvielas koncentrācija pie mērķa — lielums, ko neviena asins analīze tieši nemēra.

Ko nevajadzētu secināt

Neviena tabulas rinda nepierāda, ka metilēnzilais cilvēkam paredzami paaugstina vai pazemina kāda neirotransmitera līmeni. Enzīma inhibēšana attīrītā preparātā, transportiera bloķēšana šūnu līnijā un receptoru antagonisms audu šķēlē katrs ir kontrolēts eksperimentāls solis, kas vēl nav faktiskā norise sinapsē. Savukārt sadaļa par holīnerģisko sistēmu parāda divus patiesus atklājumus, kuru pretējie virzieni atstāj nenoteiktību. Šo lapu atbildīgi var izmantot kā karti ar iedarbības punktiem, uz kuriem molekula ir pierādīti iedarbojusies, norādot arī iedarbības stiprumu, lai mehānismu apspriešana paliktu piesaistīta tam, kas patiešām izmērīts. Par šo iedarbības punktu mijiedarbību ar recepšu medikamentiem atbildīgais avots ir mijiedarbības ceļvedis, savukārt papildu konteksts atrodams farmakoloģijas pamatu izklāstā un saistītajā mehānismu skaidrojumā.