Metilēnzilais, Nrf2 un mitohondriju bioģenēze: kas ir izmērīts un kas vēl ir hipotēze

Rakstos par metilēnzilo bieži parādās viens teikums: tas aktivē Nrf2 un veido jaunus mitohondrijus. Teikums izklausās pēc viena apgalvojuma, taču tajā ietverti divi atšķirīgi jēdzieni, kas pētīti dažādās sistēmās ar dažāda veida pierādījumiem. Pirmais ir signālceļš — sensors, kas ieslēdz aizsardzības gēnus. Otrais ir būvniecības programma — šūna veido vairāk mitohondriju struktūru un darbības komponentu. Signāls var ierosināt būvniecību, taču parādīt, ka signāls ir nostrādājis, nav tas pats, kas parādīt, ka ēka ir uzcelta, un parādīt vairāk būvmateriālu nav tas pats, kas parādīt labāku energoapgādi. Šajā rakstā šīs trīs lietas ir nošķirtas.

Nrf2 jēdziens: sensors, nevis vairogs

Nrf2 (ar eritroīdo faktoru 2 saistītais kodola faktors 2) ir transkripcijas faktors — olbaltumviela, kuras uzdevums ir ieslēgt gēnus. Miera apstākļos to citoplazmā aiztur sensora olbaltumviela Keap1, kas to nodod šūnas noārdīšanas sistēmai nepārtrauktai iznīcināšanai. Kad oksidanti vai elektrofili modificē Keap1 reaktīvos cisteīnus, noārdīšana apstājas. Jaunizveidotais Nrf2 uzkrājas, pārvietojas uz kodolu, savienojas ar mazajām Maf olbaltumvielām un saistās ar DNS sekvencēm, ko sauc par antioksidatīvās atbildes elementiem. Šī saistīšanās ieslēdz veselu aizsardzības gēnu kopumu.

Šī signālceļa kanoniskie rādītāji ir konkrēti. NQO1 (NAD(P)H hinona dehidrogenāze 1) un TrxR1 (tioredoksīna reduktāze 1) ir vieni no uzticamākajiem Nrf2 mērķgēniem. HO-1 (hēma oksigenāze-1) ir spēcīgi inducējama, taču reaģē arī uz citiem regulatoriem. Tādi enzīmi kā SOD un katalāze ir antioksidatīvās sistēmas komponenti, tomēr to līmeni kontrolē daudzi transkripcijas faktori, tāpēc SOD pieaugums pats par sevi nepierāda, ka cēlonis bijis Nrf2. Signālpārneses notikumam vistuvākie pierādījumi ir Nrf2 uzkrāšanās kodolā, ARE reportiera aktivācija vai kanonisko mērķgēnu indukcija, kas izzūd, ja Nrf2 tiek likvidēts. Viss pārējais — zemāks oksidantu līmenis, labāka izdzīvošana stresa apstākļos, vairāk glutationa — ir pakārtota ietekme, ko var radīt daudzi signālceļi.

Agrīnākais metilēnzilā rezultāts šajā stāstā atrodas tuvāk šīs skalas tiešo pierādījumu galam. Fibroblastiem, kas pakļauti metilēnzilā iedarbībai nanomolārā koncentrācijā, novēroja aizkavētu šūnu novecošanos līdztekus lielākam kompleksa IV daudzumam, lielākam skābekļa patēriņam un 2. fāzes enzīmu TrxR1 un NQO1 indukcijai, kā ziņots pētījumā, kas pirmais sasaistīja metilēnzilo ar mitohondriju darbības uzlabošanos un šūnu novecošanās aizkavēšanos. TrxR1 un NQO1 ir tieši tie kanoniskie Nrf2 mērķgēni, ko rūpīgs lasītājs vēlas redzēt. Taču pētījumā netika parādīts pats signālpārneses notikums: nebija Nrf2 mērījuma kodolā, ARE reportiera vai kontroles ar Nrf2 gēna izslēgšanu. Tāpēc godīga interpretācija ir šāda: metilēnzilais šajā sistēmā inducē zināmus Nrf2 mērķgēnus, kas atbilst Nrf2 aktivācijai, bet neļauj izdalīt Nrf2 kā cēloni. Mērķgēna indukcija ir vienu soli lejup no slēdža.

Bioģenēzes jēdziens: programma ar trim kontrolpunktiem

Mitohondriju bioģenēze ir programma, ar kuras palīdzību šūna palielina savu mitohondriālo kapacitāti. Tās mācību grāmatās aprakstītā hierarhija ietver trīs kontrolpunktus. Pirmkārt, koaktivators PGC-1alpha ieslēdz programmu. Otrkārt, kodola transkripcijas faktori (mulsinoši, bet vienu no tiem sauc NRF1 — kodola elpošanas faktors 1, kas ir cita olbaltumviela nekā Nrf2) veicina mitohondriju gēnu ekspresiju, tostarp TFAM, kas uztur un replicē mitohondriju DNS. Treškārt, šūnā galu galā ir vairāk mitohondriju genomu un vairāk elpošanas sistēmas komponentu, ko var izmērīt kā mtDNA kopiju skaitu, citrāta sintāzes aktivitāti vai elpošanas kompleksu daudzumu un aktivitāti.

Katrs kontrolpunkts ļauj izvirzīt vājāku vai spēcīgāku apgalvojumu nekā iepriekšējais. Lielāks PGC-1alpha vai TFAM matrices RNS daudzums liecina, ka programmas izpilde ir pieprasīta, nevis ka tā ir pabeigta. Vairāk mtDNA vai kompleksa IV olbaltumvielu nozīmē vairāk materiāla, taču tādu pašu ainu var radīt mitohondriju pārstrukturēšana. Labāka elpošana, lielāks skābekļa patēriņš vai kompleksu aktivitāte liecina par funkcijas izmaiņām, tomēr funkcija var uzlaboties arī bez jebkādiem jauniem mitohondrijiem. Pārliecinošs apgalvojums par bioģenēzi apvieno visus trīs: regulatoru, daudzumu un funkciju.

Turpmākais fibroblastu pētījums aptvēra lielāko daļu šīs ķēdes. Cilvēka IMR90 šūnās, kas apstrādātas ar metilēnzilo 100 nanomolārā koncentrācijā, NAD un NADH attiecība īslaicīgi pieauga 15 minūšu laikā un dienas laikā atgriezās sākotnējā līmenī. Šim īslaicīgajam enerģētiskajam signālam sekoja īslaicīga enerģijas sensora AMPK fosforilēšana, pēc tam PGC-1alpha un SURF1 indukcija; SURF1 ir olbaltumviela, kas nepieciešama funkcionējoša kompleksa IV salikšanai. Kompleksa IV aktivitāte aptuveni divkāršojās, oksidantu daudzums šūnās samazinājās par aptuveni 28 procentiem, un telomēri saīsinājās lēnāk. Pilna notikumu secība ir izklāstīta publikācijā, kas saista metilēnzilā oksidēšanās–reducēšanās aktivitāti ar AMPK un mitohondriju bioģenēzi.

Divas šīs publikācijas detaļas ir uzmanības vērtas, jo tās ir tādas detaļas, ko parasti izlaiž. Pirmkārt, aktivācijas raksturs bija svarīgāks par tās esamību: metilēnzilais ieslēdza AMPK īslaicīgi, savukārt salīdzinājumam izmantotais medikaments AICAR to ieslēdza ilgstoši, un īslaicīgais aktivators aizkavēja šūnu novecošanos aptuveni astoņas reizes efektīvāk. Tāpēc apgalvojums «metilēnzilais aktivē AMPK» ir nepilnīgs; būtiskais apgalvojums ir, ka tas aktivē AMPK īslaicīgi, un salīdzinājums liecina, ka ilgstošai aktivācijai nav tādas pašas ietekmes. Otrkārt, metilēnzilais nemainīja šūnu ciklu, kas izslēdz visvienkāršāko alternatīvo skaidrojumu: šūnas vienkārši dalījās lēnāk un tādēļ izskatījās jaunākas.

Pētījumu atzars pelēs: uzvedība, genomi un apzināti paradoksāls ierosinātājs

Šūnu kultūru pētījumus uz dzīvniekiem attiecināja grupa, kas pētīja vidēja vecuma peles. Pēc 60 dienu ilgas metilēnzilā lietošanas iekšķīgi apstrādātās peles saglabāja vairāk fiziskās izturības un izpētes uzvedības un uzrādīja mazāk trauksmei līdzīgas uzvedības nekā neapstrādātas novecojušas peles. Smadzeņu audos gēnu NRF1, TFAM, SOD2 un kompleksa IV apakšvienības COX1 ekspresija, ko novecošana bija nomākusi, atjaunojās, tuvojoties pieaugušu dzīvnieku līmenim, un mtDNA kopiju skaits pieauga. Šie rezultāti — uzvedība kopā ar regulatoriem un genomu daudzumu — ir aprakstīti pētījumā par metilēnzilo un smadzeņu mitohondriju bioģenēzi vidēja vecuma pelēs.

Interesantākais ir hipotētiskais ierosinātājs, jo tas ir pretrunā vienkāršajam stāstam, ka metilēnzilais ir antioksidants. Apstrādāto peļu smadzeņu mitohondrijos novēroja pastiprinātu reaktīvo skābekļa formu, konkrēti ūdeņraža peroksīda, veidošanos. Autoru hipotēze: tieši viegls peroksīda signāls aktivē Nrf2 signālceļu, kas pēc tam virza bioģenēzes programmu. Šajā modelī metilēnzilais ierosināšanas posmā ir prooksidants, bet rezultāta posmā — antioksidants. Šādu modeli farmakologi sauc par hormēzi: neliels stress izraisa aizsardzības reakciju, kas pārsniedz pašu stresu. Tas, vai peroksīda pieaugums patiešām izraisa Nrf2 aktivāciju, netika tieši pārbaudīts; tā ir hipotētiskā saikne, nevis izmērīts savienojums.

Tās pašas grupas saistītā pētījumā tika rūpīgi pārbaudīta šīs hipotēzes drošuma puse. Izolētos smadzeņu mitohondrijos metilēnzilais palielināja ūdeņraža peroksīda veidošanos jau 50 nanomolārā koncentrācijā, tomēr terapeitiskās koncentrācijas neradīja nosakāmus mitohondriju DNS bojājumus. Tikai 100 mikromolārā koncentrācijā, kas ievērojami pārsniedz terapeitisko līmeni, atsevišķos mtDNA fragmentos konstatēja bojājumus, savukārt krāsvielas 20 mikromolārā koncentrācijā un sarkanās gaismas kombinācija radīja singleta skābekli, kas plaši bojāja mtDNA. Tā ir zināmā krāsvielas darbība kā fotosensibilizatoram, nevis tās farmakoloģiskā darbība tumsā. Iepriekšēja apstrāde pat aizsargāja vidussmadzeņu ventrālās daļas mitohondrijus pret rotenona izraisītiem mtDNA bojājumiem. Devas un atbildes reakcijas attiecība un genotoksicitātes kontroles ir detalizēti aprakstītas pētījumā par metilēnzilā izraisītu peroksīda veidošanos bez genotoksicitātes.

Izmērītais un hipotētiskais: shēmas lasīšana

Tālāk redzamā signālceļu shēma tika izveidota šim rakstam, lai skaidri nostiprinātu tekstā izmantoto nošķīrumu. Rāmīši ar nepārtrauktām līnijām apzīmē posmus, kam metilēnzilā literatūrā ir tiešs eksperimentāls pamatojums: oksidēšanās–reducēšanās cikli, kas maina NAD/NADH attiecību, īslaicīga AMPK fosforilēšana, PGC-1alpha un SURF1 indukcija, lielāka kompleksa IV aktivitāte, NQO1 un TrxR1 indukcija, bioģenēzes gēnu ekspresijas un mtDNA kopiju skaita atjaunošanās peļu smadzenēs un peroksīda līmeņa paaugstināšanās bez mtDNA bojājumiem pie terapeitiskām devām. Rāmīši ar pārtrauktām līnijām apzīmē hipotētiskās saiknes: peroksīda signāla uztveršanu ar Keap1, Nrf2 uzkrāšanos kodolā, kas virza aizsardzības gēnu ekspresiju, un cēloņsakarības bultu no Nrf2 aktivācijas uz bioģenēzes programmu. Šie ar pārtrauktām līnijām apzīmētie posmi ir ticami, saskan ar datiem un atbilst ierastajai mācību grāmatu bioloģijai, taču šajās publikācijās tie netika izmērīti ar kontrolēm (Nrf2 kodolā, ARE reportieri, Nrf2 gēna izslēgšana), kas ļautu tos attēlot ar nepārtrauktām līnijām.

Kad shēma ir acu priekšā, kļūst redzami trīs pārpratumi. Pirmkārt, NRF1 un Nrf2 ir atšķirīgas olbaltumvielas ar gandrīz identiskiem nosaukumiem; peļu pētījumā mērīja kodola elpošanas faktoru 1, bioģenēzes regulatoru, nevis antioksidatīvo transkripcijas faktoru, un to sajaukšana saplacina visu shēmu vienā mezglā. Otrkārt, gēnu ekspresija ir stāsta sākums, nevis beigas; atjaunots TFAM vai COX1 matrices RNS līmenis norāda uz bioģenēzes pieprasījumu, savukārt mtDNA kopiju skaits un kompleksa IV aktivitāte ir pierādījumi, ka pieprasījums ir izpildīts. Treškārt, antioksidatīvais rezultāts nepierāda Nrf2 ceļu; oksidantu samazinājums fibroblastos par 28 procentiem un aizsardzība pret rotenona iedarbību pelēs ir reālas pakārtotas sekas, taču pie tām saplūst vairāki signālceļi.

Kas ļautu pārtrauktu līniju rāmīti aizstāt ar nepārtrauktu

Trūkstošie eksperimenti ir standarta eksperimenti. Nrf2 olbaltumvielas noteikšana kodolā pēc metilēnzilā iedarbības, izmantojot laika gaitu, kas saskaņota ar īslaicīgo AMPK signālu, ļautu pārbaudīt, vai abi atzari patiešām aktivējas kopā, kā apgalvo sinhronizētās aktivācijas hipotēze. ARE vadīts reportieris apstiprinātu transkripcijas aktivitāti, nevis ļautu to tikai secināt no mērķgēniem. Bioģenēzes mērījumu atkārtošana, nomācot Nrf2 ekspresiju vai izslēdzot tā gēnu, tieši pārbaudītu cēloņsakarības bultu: ja kompleksa IV indukcija un mtDNA pieaugums saglabājas bez Nrf2, saikne ir kļūdaina un ietekmi nodrošina tikai AMPK atzars. Dzīvnieku pētījumos ilgstošas lietošanas pētījums ar tiem pašiem trim kontrolpunktiem — regulatoru, daudzumu un funkciju — ļautu pārbaudīt, vai programma paliek ieslēgta vai pielāgojas. Līdz tam enerģētisko un aizsardzības signālceļu sinhronizētā aktivācija paliek tas, kā to nosaukuši tās autori: iespējams būtisks faktors, nevis pierādīts mehānisms.

Lasītājiem, kuri šo tēmu aplūko plašākas farmakoloģijas kontekstā, var būt noderīgs apkārtējais konteksts: kā metilēnzilais pārnes elektronus mitohondriju līmenī, kā vēl tas ietekmē mitohondrijus un šūnu enerģētiku, kāda ir šūnu novecošanās atradņu vieta novecošanas pētījumos, kā apgalvojumi par bioģenēzi ir saistīti ar kognitīvajām spējām un kādi drošuma dati nosaka robežas jebkurai diskusijai par devām. Katrs no šiem ir atsevišķs jēdziens ar saviem pierādījumiem, un katrs ir pelnījis tādu pašu izmērītā un hipotētiskā nošķīrumu, kādu šis raksts piemēroja Nrf2.