Kāpēc metilēnzilo izmanto kā kontrastkrāsvielu krāsošanā skābju izturības noteikšanai

Laboratorijas speciālists pēc visas krāsošanas procedūras pārbauda krēpu uztriepi. Uz zila fona izceļas sarkanas nūjiņas, un rezultātā tiek norādīts, ka redzami skābju izturīgi baciļi. Nākamajā dienā citā preparātā redzams vienmērīgi zils lauks bez sarkanām nūjiņām, un rezultāts tiek ziņots kā negatīvs attiecībā uz tuberkulozi. Viens no šiem ziņojumiem apgalvo vairāk, nekā preparāts ļauj secināt, un tas nav pirmais.

Pārpratums ir konceptuāls. Speciālists uzskatīja zilo krāsvielu par noteikšanas ķīmijas daļu, it kā metilēnzilais palīdzētu atrast mikobaktērijas. Tā nav. Kad metilēnzilais nonāk uz priekšmetstikliņa, pārbaude jau ir beigusies. Krāsviela tikai iekrāso fonu, lai rezultātu varētu nolasīt. Šajā rakstā skaidrots metilēnzilā uzdevums krāsošanā skābju izturības noteikšanai, kāpēc tas ir zils, nevis kādā citā krāsā, un ko sarkanais uz zilā fona ļauj secināt.

Īsā atbilde

Krāsošana skābju izturības noteikšanai ir diferenciāla pārbaude, kuras pamatā ir trīs principi. Karbolfuksīnu, primāro krāsvielu, piespiedu kārtā ievada katrā šūnā, tostarp mikobaktērijās ar vaskveida apvalku. Skābes un spirta maisījums, atkrāsotājs, izskalo sarkano krāsvielu no parastām šūnām, bet nespēj to izvilkt no skābju izturīgām šūnām. Pēc tam metilēnzilais, kontrastkrāsviela, iekrāso visu, no kā atkrāsotājs izskalojis krāsvielu, tāpēc šūnas, kas nav skābju izturīgas, saimniekorganisma šūnas un atliekas izskatās zilas, bet skābju izturīgie baciļi paliek sarkani. Kontrastkrāsviela nodrošina kontrastu. Tā nepiedalās ķīmiskajos procesos, kas nosaka šūnas skābju izturību.

Katra posma uzdevums

Tālāk redzamā shēma parāda uzdevumu sadalījumu. Lasiet to no kreisās uz labo pusi kā procedūru, bet apakšējo joslu — kā atgādinājumu, ka katra krāsošanas metožu grupa atbild uz citu jautājumu.

Vispirms notiek krāsvielas iekļūšana. Mikobaktērijas pretojas parastām ūdens šķīdumā esošām krāsvielām, jo to apvalks ir neparasti hidrofobs, tāpēc protokols nodrošina piespiedu iekļūšanu. Ziehl–Neelsen metodē karsēšana līdz tvaika veidošanās brīdim ievada fenolu saturošo karbolfuksīnu caur vaskveida šūnapvalku. Kinyoun aukstajā metodē karsēšanu aizstāj ar daudz koncentrētāku primārās krāsvielas sastāvu, un dažos modificētos variantos bez karsēšanas pievieno virsmaktīvās vielas. Amerikas Mikrobioloģijas biedrības krāsošanas protokolos skābju izturības noteikšanai abi sastāvi aprakstīti līdzās, un koncentrāciju atšķirība ir ievērojama: aptuveni 0.3 g bāziskā fuksīna uz 100 mL karsētajai metodei pret aptuveni 4 g aukstajai metodei.

Otrajā posmā notiek diferenciācija. Skābes un spirta maisījums, parasti 3 mL koncentrētas sālsskābes 97 mL 95 procentu etanola, izskalo sarkano krāsvielu no katras šūnas, kuras šūnapvalks nenodrošina īpašu izturību. Šūnas ar neskartu mikobaktēriju lipīdu apvalku krāsvielu saglabā. Šis ir posms, uz kura balstās visa metode, un tas ir visjutīgākais pret izpildījuma kļūdām, kā aplūkots tālāk.

Kontrasts tiek radīts pēdējais. Uz priekšmetstikliņa tagad atrodas sarkanas skābju izturīgas šūnas uz gandrīz bezkrāsaina atkrāsoto šūnu fona. Metilēnzilais 0.3 procentu w/v koncentrācijā atjauno šī fona redzamību krāsā, kas maksimāli atšķiras no sarkanās. Kontrastkrāsošana ir īsa — parasti 20 līdz 30 sekundes karsētajā metodē un līdz dažām minūtēm dažos aukstās metodes variantos; ilgumu nosaka protokols, nevis pašas krāsvielas īpašības.

Kāpēc šī krāsviela un kāpēc zila

Metilēnzilais ir katjoniska bāziska krāsviela: tā krāsainajam jonam ir pozitīvs lādiņš, un tas saistās ar atkrāsoto baktēriju, saimniekorganisma šūnu un atlieku negatīvi lādētajām virsmām. OpenStax mikrobioloģijas mācību grāmatā šī lādiņu mijiedarbība aprakstīta kā bāzisko krāsvielu vispārējais darbības princips. Taču metilēnzilais šajā ziņā nav ķīmiski unikāls. Arī kristālviolets un safranīns ir bāziskas krāsvielas. Izvēli nosaka optika, nevis ķīmija.

Sarkanajām nūjiņām vajadzīgs kontrastējošas nokrāsas fons, un zilais vislabāk pretstatās sarkanajam gaišā lauka mikroskopijā. Safranīns būtu slikta kontrastkrāsviela, jo tā radītā rozā–sarkanā gala krāsa ir pārāk līdzīga saglabātā karbolfuksīna krāsai, iznīcinot tieši to atšķirību, ko procedūra radījusi. Kristālviolets radītu tumši violetu fonu, kas konkurētu ar tievajiem sarkanajiem baciļiem par uzmanību. Spēcīgākais pierādījums tam, ka uzdevums ir radīt kontrastu, nevis nodrošināt ķīmisku procesu, ir aizstājamība: dažos veterinārajos un modificētajos protokolos izmanto zaļas kontrastkrāsvielas, piemēram, malahītzaļo un briljantzaļo, un pārbaude joprojām darbojas, jo jebkura skaidri atšķirīga nokrāsa pilda to pašu uzdevumu.

No tā izriet divi praktiski secinājumi. Pirmkārt, standarta receptē nav paredzēta pH regulēšana; nejauciet šo vienkāršo 0.3 procentu ūdens šķīdumu ar sārmainiem sastāviem, piemēram, Leflera metilēnzilo, kas pieder citam krāsošanas principam. Otrkārt, pārmērība kaitē. Histoloģijas literatūrā īpaši brīdināts, ka pārāk intensīvs zils fons var aizsegt nelielu baciļu skaitu, tāpēc ilgāka krāsvielas turēšana uz priekšmetstikliņa, nekā atļauj protokols, pasliktina nolasāmību bez jebkāda ieguvuma.

Šūnapvalka ķīmija, kas padara pārbaudi iespējamu

Skābes un spirta maisījuma spēja atšķirt šūnas ir saistīta ar mikobaktēriju apvalku. Tā strukturālais pamats ir mikolil-arabinogalaktāna-peptidoglikāna komplekss: peptidoglikāns ir saistīts ar arabinogalaktānu, kura ārējiem galiem pievienotas mikolskābes ar ļoti garām ķēdēm, veidojot lipīdiem bagātu ārējo mikomembrānu ar neparasti zemu caurlaidību. Pārskatā par mikobaktēriju ārējo membrānu šī uzbūve aprakstīta detalizēti. Barjera darbojas abos virzienos. Tā pretojas krāsvielas iekļūšanai, tāpēc vajadzīga karsēšana vai koncentrētāka primārā krāsviela, un pretojas krāsvielas izvilkšanai, tāpēc skābes un spirta maisījums nespēj izskalot karbolfuksīnu, kad tas jau ir iekšā. Parastām baktērijām šāda apvalka nav, un tās krāsvielu zaudē. Tāpēc skābju izturību vislabāk saprast kā lipīdu barjeras parādību, nevis kā fuksīna ķīmisku saistīšanos ar mikolskābi.

Šī ķīmija izskaidro arī bieži sastopamu neskaidrību: ar Grama metodi mikobaktērijas krāsojas vāji un neparedzami, dažkārt izskatoties kā blāvas, krellēm līdzīgas formas vai neiekrāsotas ēnveida struktūras. To hidrofobais šūnapvalks ierobežo kristālvioleta iekļūšanu. Krāsošana skābju izturības noteikšanai nav modificēta Grama krāsošana. Tas ir cits diferenciācijas princips, kas balstās uz citu šūnapvalka īpašību, kā pārējo divu metožu gadījumā parāda vienkāršās krāsošanas un Grama krāsošanas salīdzinājums.

Trīs metodes, trīs jautājumi

Plašāku informāciju par baktēriju krāsošanas metodēm ar vienu krāsvielu skatiet mikroskopiskās krāsošanas atlantā.

Ko sarkanais uz zilā fona nevar pierādīt

Sarkanas nūjiņas nozīmē, ka mikroorganismi saglabājuši karbolfuksīnu pēc skābes un spirta maisījuma iedarbības. Šāda atradne atbilst Mycobacterium tuberculosis, taču CDC tuberkulozes diagnostikas vadlīnijās skaidri norādīts, ka arī citas mikobaktērijas ir skābju izturīgas, tāpēc sugas identificēšanai nepieciešama kultivēšana un nukleīnskābju testēšana, nevis krāsas novērtēšana.

Izpildījuma kļūdas galvenokārt saistītas ar abiem skalošanas posmiem. Nepietiekama atkrāsošana atstāj fona materiālu sarkanu un veicina kļūdaini pozitīvu interpretāciju. Pārmērīga atkrāsošana izskalo vāji saglabāto primāro krāsvielu un veicina kļūdaini negatīvus rezultātus. Pārāk intensīva kontrastkrāsošana noslēpj nelielu baciļu skaitu zilajā fonā. Biezas uztriepes, izgulsnējušies reaģenti un piesārņots skalošanas ūdens rada papildu artefaktus.

Jutību ierobežo mikroorganismu daudzums neatkarīgi no tā, cik precīzi veikta procedūra. Parastai uztriepes mikroskopijai vajadzīgi aptuveni 5,000 līdz 10,000 baciļu uz mililitru krēpu, un agrākos CDC pierādījumu pārskatos uztriepes jutība plaušu tuberkulozes gadījumos, kas apstiprināti ar kultivēšanu, bija aptuveni 45 līdz 80 procenti. Tāpēc negatīva uztriepe nekad neizslēdz tuberkulozi. Pašreizējās CDC vadlīnijas paredz kultivēšanu līdztekus katras uztriepes izmeklēšanai un iesaka nukleīnskābju amplifikācijas testēšanu vismaz vienam elpceļu paraugam, ja tiek apsvērta plaušu tuberkuloze un rezultāts mainītu turpmāko rīcību.

Praktiskais darbs jāveic pēc apstiprinātiem protokoliem

Mācību apraksti, tostarp šis raksts, nedod tiesības veikt klīnisko darbu. Praktiskajā laboratorijas darbā ievērojiet laboratorijas validēto standarta darba procedūru, kas saskaņota ar aktuālajiem CDC, APHL vai CLSI dokumentiem; CDC atsauces dokuments par krāsošanu skābju izturības noteikšanai tā Stacks arhīvā parāda, kā šādās procedūrās nosaka reaģentus un rezultātu nolasīšanu. Darbam ar tuberkulozes paraugiem nepieciešami bioloģiskās izolācijas pasākumi: uztriepes sagatavo bioloģiskās drošības skapī, jo sagatavošanas laikā rodas aerosoli un šļakatas, un CDC laboratorijas drošības vadlīnijās norādīts, ka pat ar karstumu fiksētas uztriepes var saturēt dzīvotspējīgus tuberkulozes baciļus un ar tām joprojām jārīkojas kā ar kontaminētu materiālu. CDC Sabiedrības veselības attēlu bibliotēkas ieraksts par uztriepi, kas krāsota ar karbolfuksīnu un metilēnzilo un pārbaudīta M. leprae noteikšanai, noderīgi atgādina, ka metodes izmantošana neaprobežojas ar tuberkulozi: tas pats sarkanā un zilā kontrasts kalpo visur, kur meklē skābju izturīgus mikroorganismus, un arī rūpīgi iegūts negatīvs rezultāts ir reģistrēšanas vērts.

Gatavā preparāta nolasīšana

Kontrastkrāsvielas nozīme atklājas sākotnējā apskatē. Mikroskopētājs, pārlūkojot preparātu nelielā palielinājumā, vispirms izmanto zilo fonu, lai novērtētu uztriepes kvalitāti: vienmērīgu šūnu izvietojumu, neskartas saimniekorganisma šūnas fokusēšanai un izteiktu nogulšņu neesamību. Iespējamie sarkanie baciļi pēc tam piesaista skatienu tieši tāpēc, ka nekas cits preparātā nav sarkans. Apstiprināšana notiek eļļas imersijā, kur īsti baciļi izskatās kā sagaidāmās tievās, dažkārt nedaudz izliektās vai krellēm līdzīgās nūjiņas, nevis vienveidīgas krāsvielas atliekas.

Fona krāsojums nosaka arī rezultāta formulējumu. Ja preparātā ir sarkani baciļi, ziņo, ka redzami skābju izturīgi baciļi, bieži norādot puskvantitatīvu novērtējumu pēc laboratorijas skalas. Ja preparātā nav sarkanu mikroorganismu, ziņo, ka skābju izturīgi baciļi nav redzami, nekad — ka rezultāts ir negatīvs attiecībā uz tuberkulozi. Šī atšķirība ir svarīga, jo zilais lauks pierāda, ka krāsošana ir izdevusies, šūnas ir uzņēmušas kontrastkrāsvielu un optika bijusi atbilstoša, bet neko nepasaka par mikroorganismiem, kuru daudzums ir zem noteikšanas robežas. Zils lauks bez baciļiem ir derīgs rezultāts par preparātu, nevis slēdziens par pacientu.

Atcerieties uzdevumu sadalījumu, un rezultātu formulēšana kļūst vienkārša. Karbolfuksīns atklāj iespējamos baciļus. Skābes un spirta maisījums veic pārbaudi. Metilēnzilais tikai padara atbildi nolasāmu: sarkanais saglabāja krāsvielu skābes iedarbībā, zilais to zaudēja. Viss pārējais — suga, mikroorganismu daudzums un klīniskā nozīme — izriet no darba ārpus šī preparāta.