Metilēnzilais kā anaerobiozes un skābekļa indikators: ko pierāda krāsas maiņa

Laborante noslēdz anaerobo trauku, caur vāku pārbauda metilēnzilā indikatorstrēmeli un ierauga to, ko vēlas redzēt. Strēmele no zilas kļuvusi balta. Viņa reģistrē izmēģinājumu kā anaerobu un turpina darbu. Pēc divām dienām vienā platē nekas nav izaudzis, savukārt noslēgtā buljona mēģenē tajā pašā traukā redzamas skābekļa iedarbības pazīmes. Strēmele rādīja patiesību. Laborante tai uzdeva nepareizo jautājumu.

Neskaidrības cēlonis ir jēdzienu sajaukšana. Metilēnzilā anaerobiozes indikators raksturo redoksapstākļus, nevis sterilitāti vai visas sistēmas validāciju. Kad šī atšķirība ir skaidra, strēmele kļūst par precīzu un uzticamu instrumentu ar šauri noteiktu uzdevumu.

Pamatprincips: atgriezenisks redokspāris

Izšķīdis metilēnzilais pastāv divos stāvokļos. Oksidētā forma ir pazīstamais zilais katjons. Reducētā forma, ko sauc par leikometilēnzilo, ir bezkrāsaina. Pie gandrīz neitrāla pH vienkāršotajā pusreakcijā viens zilais katjons kopā ar vienu protonu un diviem elektroniem veido vienu bezkrāsainu leikoformas molekulu. Formālais potenciāls pie pH 7 ir aptuveni plus 11 milivolti attiecībā pret standarta ūdeņraža elektrodu. Tas ir diapazonā, ko var sasniegt daudzas reducējošas sistēmas un kurā skābeklis var izraisīt pretējo reakciju.

Reducēšanai nepieciešams zems lokālais redokspotenciāls. Ar skābekļa aizvākšanu vien ne vienmēr pietiek. Agrīnajos anaerobiozes pētījumos konstatēja, ka metilēnzilais parastā ūdenī bez skābekļa saglabāja krāsu, ja nebija reducējošas vielas, un ka dekstrozes buljona maisījumi ar aptuveni 0.01 procentu krāsvielas viegli atkrāsojās pie 37 C, savukārt tas pats maisījums, turēts pie 4 C, palika zils veselu dienu, kā aprakstīts eksperimentos ar svaigiem audiem un anaerobas kultivēšanas apstākļiem. Temperatūra, pH, glikoze, askorbāts, tioglikolāts un mikroorganismu reducējošā aktivitāte nosaka, vai elektroni ir pieejami.

Atkārtotai oksidēšanai vajadzīgs tikai skābeklis. Kad gaiss sasniedz leikoformu, tā atkal kļūst zila. Mūsdienu īpaši izstrādātie indikatori izmanto tieši šo ciklu: krāsviela kopā ar reducētāju un stabilizējošu matricu ir bezkrāsaina zemā skābekļa līmenī un atkal kļūst zila, saskaroties ar gaisu. Tas parādīts hibrīdā metilēnzilā skābekļa indikatorā, kura pamatā ir krāsviela, reducētājs, virsmaktīvā viela un māls. Šajā prototipā izmantoja krāsvielu 0.01 milimolārā koncentrācijā ar askorbātu vai glikozi 2.0 milimolārā koncentrācijā pie pH 11. Tas kļuva bezkrāsains pie aptuveni 0.5 tilpumprocentiem skābekļa un testa kamerā ļāva atšķirt skābekļa līmeni zem 0.1 procenta no līmeņa virs 0.5 procentiem.

Tātad darbības princips ir vienkāršs. Zila krāsa nozīmē, ka indikatora zona ir oksidēta. Bezkrāsains stāvoklis nozīmē, ka indikatora zonā ir sasniegti reducējoši apstākļi ar zemu skābekļa līmeni. Pārmaiņa ir atgriezeniska, lokāla un ķīmiska. Pati par sevi tā neko nepasaka par mikroorganismiem.

Kā metilēnzilā indikatorstrēmele darbojas anaerobajā traukā

Metilēnzilā indikatorstrēmele anaerobajam traukam ir neliela reakcijas zona, ko ievieto trauka atmosfērā tā, lai to varētu redzēt, neatverot trauku. Komerciālie formāti atšķiras: papīra strēmeles, tabletes, ko sagatavošanas laikā izšķīdina vai samitrina, un jaunāki hibrīdpapīri. Dažiem reakcijas zonas aktivizēšanai nepieciešams viens piliens destilēta ūdens. Citi ir sausa formāta indikatori, kam jāpaliek sausiem. Jāievēro konkrētā produkta instrukcija, jo hidratācija, novietojums un nolasīšanas laiks ir daļa no ķīmiskā procesa.

Praksē paredzēti divi rādījuma varianti. Zila krāsa nozīmē, ka pie strēmeles saglabājas skābeklis vai nepietiekami reducējoši apstākļi. Balta vai bezkrāsaina strēmele nozīmē, ka pie tās ir izveidoti anaerobi redoksapstākļi. Dažiem komerciālajiem indikatorpapīriem pievienots sarkans fona pigments, tāpēc reducētajā galastāvoklī tie izskatās rozā, nevis balti. Pirms vērtēšanas noskaidrojiet, kādu galastāvokli paredz jūsu produkts.

Laiks dažādās sistēmās atšķiras. Vienā GasPak tipa sistēmā krāsa sāka izbalēt aptuveni stundas laikā un pilnībā izzuda dažu stundu laikā, savukārt kontrolētā salīdzinājumā istabas temperatūrā metilēnzilajam vajadzēja vairāk nekā sešas stundas. Šajā pētījumā barotņu redokspotenciāls 60 līdz 100 minūšu laikā sasniedza aptuveni mīnus 100 milivoltus — krietni pirms krāsvielas maiņas beigām — un bija ievērojami zem mīnus 200 milivoltiem, kad strēmele kļuva pilnībā bezkrāsaina. Indikators atpaliek no atmosfēras pārmaiņām. Zila strēmele pirmajā stundā nepierāda kļūmi, un balta strēmele sestajā stundā raksturo strēmeles stāvokli sestajā stundā.

Tā paša iemesla dēļ svarīgs ir novietojums. Turiet strēmeli gāzes telpā virs paraugiem, redzamu caur vāku un prom no agara virsmām un barotnēm. Tā raksturo savu tiešo apkārtni. Ja to novietojat cieši pie aukstas sienas, paslēpjat zem platēm vai ļaujat tai izmirkt kondensātā, tā raksturo šo mikrovidi, nevis trauku.

Ko strēmele parāda un ko tā neparāda

Uztveriet metilēnzilā indikatoru anaerobajā traukā kā vienu sensoru vienā vietā. Tas ļauj noteikt lokālos redoksapstākļus un skābekļa apstākļus savā reakcijas zonā, kas kopumā var raksturot gāzes telpu, ja sajaukšanās un līdzsvara izveidošanās ir pietiekama. Viss pārējais ir secinājums, un secinājumam vajadzīgi atsevišķi pierādījumi.

Bezkrāsaina strēmele neapstiprina sterilitāti. Sterilitāte nozīmē dzīvotspējīgu organismu neesamību, ko pierāda validēta sterilizācija un kultivēšanas validācijas kontroles. Trauks var būt pilnībā anaerobs un tomēr piesārņots vai pilnībā sterils un tomēr aerobs.

Tā nevalidē visas kultivēšanas sistēmas daļas. Viena strēmele neuzrāda izšķīdušo skābekli noslēgtā mēģenē, dziļi agarā ieslēgtu skābekli, gradientus pārpildītā traukā vai noplūdi, kas rodas pēc rādījuma nolasīšanas. Telpiskos eksperimentos vienā traukā novēroja blakus esošas zilas un bezkrāsainas zonas, kurās skābekļa iespiešanās un reducējošās aktivitātes līdzsvars atšķīrās. Viens punkts nevar apstiprināt apstākļus visā tilpumā.

Tā nepierāda nepārtrauktu anaerobiozi. Strēmele, kas nolasīta tikai vienreiz sagatavošanas laikā, neko nepasaka par divdesmito stundu. Jaunākajos pētījumos par anaerobo apstākļu kvalitāti brīdināts, ka ķīmiskie indikatori raksturo atmosfēru nolasīšanas brīdī un var izskatīties atbilstoši, lai gan saglabājas neliels skābekļa atlikums. Strēmeles rādījumu ar inkubācijas norisi saista nepārtraukta dokumentēšana vai dokumentēšana kontrolpunktos, nevis viens skatiens uz galastāvokli.

Par krāsas maiņas ķīmisko pamatu lasiet rakstā kā metilēnzilais cikliski pāriet starp oksidēto un reducēto stāvokli. Par skābekļa plašāko ietekmi uz darbu ar paraugiem skatiet skābekļa kontroli mikroskopijas un kultivēšanas darbā.

Shēma, ko turēt pie trauka

Tālāk redzamajā attēlā raksta saturs apkopots vienā uzziņu materiālā darba vietai. Tajā parādīti trīs vienas un tās pašas strēmeles stāvokļi, abi reakcijas virzieni un robeža starp indikatora sniegtajiem pierādījumiem un sistēmas validāciju.

Kļūmes, kuru dēļ strēmele paliek zila vai rada nepamatotu pārliecību

Lielākā daļa kļūmju ietilpst piecās grupās. Katrai ir raksturīgas pazīmes.

Necaurlaidību zaudējis trauks vai maisiņš nepārtraukti pievada reakcijas zonai skābekli. Strēmele paliek zila vai pēc izbalēšanas atkal kļūst zila. Pirms vainot ķīmisko procesu, pārbaudiet vāku, blīvi, skavas un blīvējošās virsmas.

Izlietots vai nepareizi aktivizēts gāzes ģenerators skābekli neaizvāc. Vecākās ar ūdeni aktivizējamās sistēmās kondensāta neparādīšanās aptuveni pēc 10 līdz 15 minūtēm un vāka nesasilšana aptuveni pēc 20 līdz 40 minūtēm bija agrīni brīdinājuma signāli šai sistēmai. Pārāk maza paciņa pārpildītā traukā neizpilda savu uzdevumu tādā pašā veidā.

Saindēts katalizators attiecas tikai uz vecākām ūdeņraža un pallādija sistēmām, kurās pallādijs veicina ūdeņraža un skābekļa savienošanos ūdenī. Mitrums un sērūdeņradis pasliktina tā darbību. Daudzās mūsdienu paciņās pallādija nav vispār, tāpēc neizmantojiet šo risinājumu tur, kur tas nav attiecināms.

Degradējusies vai nepareizi lietota strēmele var nedarboties bez acīmredzamām pazīmēm. Krāsviela un reducētājs uzglabāšanas laikā zaudē spēju nodrošināt atgriezenisku reakciju. Tas ir viens no iemesliem, kāpēc izstrādāti hibrīdsastāvi, kas pretojas gaismas izraisītai izbalēšanai un īpašību zudumam uzglabāšanas laikā. Noraidiet krājumus ar beigušos derīguma termiņu, krājumus ar neparastu sākotnējo krāsu un strēmeles, kas samitrinātas, lai gan tām jābūt sausām, vai atstātas sausas, lai gan tās jāsamitrina.

Gradients vai aizkave maldina nolasītāju, nevis izjauc ķīmisko procesu. Nepietiekami sajauktā gāzes telpā, noslēgtās mēģenēs ar izšķīdušu skābekli un puscietās barotnēs vietējie apstākļi saglabājas ilgāk, nekā liek domāt strēmele. Rezazurīna strēmeles kļūst rozā un pēc tam bezkrāsainas, un tās bieži reklamē kā ātrākas, taču to sliekšņi ir atkarīgi no konkrētā sastāva un nav pārnesami uz metilēnzilo.

Kontroles un nolasīšanas protokols, ko vērts pārņemt

Divas lētas kontroles ļauj atklāt lielāko daļu nepareizo interpretāciju. Līdzās izmēģinājumam turiet svaigu gaisa kontroles strēmeli telpas gaisā. Darbojoša metilēnzilā strēmele tur paliek zila. Daži iepakoti indikatori sākumā ir bāli un pēc atvēršanas kļūst zili, kas pats par sevi ir darbības pārbaude. Periodiski ievietojiet svaigu strēmeli arī iepriekš validētā anaerobā sistēmā. Tai produktam norādītajā laikā jāsasniedz validētais reducētais galastāvoklis. Ja kāda no kontrolēm uzvedas neatbilstoši, nomainiet partiju, pirms uzticaties rādījumiem traukā.

Nolasīšanas protokols izriet no darbības mehānisma. Novietojiet strēmeli gāzes telpā tā, lai tā būtu redzama, neatverot trauku, un ievērojiet produkta instrukciju par saskari ar sienu un samitrināšanu. Reģistrējiet sākotnējo krāsu, trauka noslēgšanas laiku un krāsu produktam norādītajā kontrolpunktā. Ja trauks to ļauj, reģistrējiet, ka indikators noteiktos kontrolpunktos inkubācijas laikā saglabāja reducēto stāvokli. Reģistrējiet galīgo krāsu tieši pirms atvēršanas. Šī krāsa pirms atvēršanas ir konkrētā izmēģinājuma gala rādījums. Pēc atvēršanas sagaidiet zilās krāsas atjaunošanos un neļaujiet tai mainīt iepriekšējo vērtējumu.

Ja strēmele pēc norādītā laika paliek zila, uzskatiet anaerobiozi par neapstiprinātu. Pārbaudiet secīgi: blīvējumu, paciņu, katalizatoru, ja tāds ir, indikatora hidratāciju un derīguma termiņu un pēc tam indikatora darbību salīdzinājumā ar gaisa kontroli. Tikai pēc atmosfēras apstākļu apstiprināšanas drīkst interpretēt augšanu vai tās neesamību, izmantojot konkrētajam lietojumam atbilstošu anaerobās kultivēšanas sistēmu un organismu kontroles.

Savā kompetences jomā strēmelei pienākas pēdējais vārds. Zila vai bezkrāsaina — tā atbild uz vienu jautājumu par vienu vietu vienā laikā. Uzdodiet šo jautājumu noteiktajā laikā un ar kontrolēm līdzās, un tā atbildēs uzticami. Jautājiet par sterilitāti, katru mēģeni vai visu inkubāciju, balstoties uz vienu skatienu, un nekāda indikatora ķīmija nespēs padarīt šo interpretāciju pamatotu.