Metilēnzilais un autofāgija: AMPK, mTOR un eksperimenti ar neironiem

Iedomājieties, ka veicat eksperimentu ar šūnām, pievienojat metilēnzilo un redzat, ka imūnblotā kļūst tumšāka proteīna josla, ko sauc par LC3-II. Var rasties kārdinājums paziņot, ka savienojums «veicina autofāgiju», un ar to arī aprobežoties. Šāda interpretācija ir pāragra. Tumšāka LC3-II josla var nozīmēt, ka šūna veido vairāk attīrīšanas pūslīšu, vai arī to, ka pūslīši uzkrājas, jo noārdīšanas posms ir bloķēts. Šīs divas interpretācijas norāda uz pretējiem procesiem, un literatūrā par metilēnzilo neironu kontekstā ir abu veidu pierādījumu piemēri. Šajā rakstā aplūkots, kas patiesībā tika mērīts, analizējot katru metodi atsevišķi.

Makroautofāgija — šeit pētītais autofāgijas veids — ir šūnas mehānisms materiāla pārstrādei lielā apjomā. Membrānas veidojums, ko sauc par fagoforu, aug ap nolietotiem proteīniem un organellām, noslēdzas, izveidojot autofagosomu, saplūst ar lizosomu, un tā saturs tiek noārdīts un atbrīvots atkārtotai izmantošanai. Neironi ir atkarīgi no šī procesa, jo tie nedalās un nevar mazināt bojāto sastāvdaļu koncentrāciju dalīšanās ceļā. Kad pārstrāde apstājas, atkritumi uzkrājas. Kad tā darbojas, šūna stresa apstākļos atgūst celtniecības materiālus.

Ko parādīja viens eksperiments ar hipokampa šūnām

Galvenajā indukcijas pētījumā izmantoja HT22 peles hipokampa šūnas, kurām radīja stresu, 24 stundas uzturot tās bez seruma. Šādos apstākļos tiek atņemti augšanas faktori un trofiskie signāli, izraisot gan apoptozi, gan autofāgiju. Pētnieki ziņoja, ka metilēnzilais samazināja šūnu bojāeju atkarībā no devas un šo aizsardzību pavadīja makroautofāgijas pazīmes.

Marķieru izmaiņas bija konkrētas. Difūzais LC3B krāsojums pārdalījās punktveida struktūrās ap kodolu, sākot aptuveni no 20 nM metilēnzilā koncentrācijas, un izteiktākā LC3-I un LC3-II atbildes reakcija bija pie aptuveni 1 μM. Gan LC3B-I, gan LC3B-II daudzums pieauga atkarībā no devas un laika. Būtiski, ka pētnieku grupa neaprobežojās ar statisku LC3 imūnblotu. Viņi pievienoja 10 μM hlorokvīna, kas bloķē lizosomālo noārdīšanu, un ar metilēnzilo apstrādātajās šūnās konstatēja lielāku LC3-II daudzumu un stabilizētu p62. Šāda aina atbalsta no lizosomām atkarīgu apriti, nevis vienkāršu uzkrāšanos. Viņi arī parādīja, ka hlorokvīns daļēji mazināja antiapoptotisko iedarbību, sasaistot aizsardzību ar autofāgijas un lizosomu ceļu šajā modelī.

Signālpārneses rezultāts ir tā daļa, ko visbiežāk citē nepareizi. AMPK signālpārnese, ko vērtēja pēc fosforilētā AMPK un tā pakārtotā mērķa — fosforilētā ACC —, pieauga pēc 12 un 24 stundām atkarībā no devas. AMPK inhibitors Compound C, ko pēdējās 4 stundās lietoja 20 μM koncentrācijā, samazināja gan ACC fosforilāciju, gan LC3 aktivāciju. Savukārt fosforilētā mTOR nomākšana netika konstatēta. Tātad stresam pakļautajās hipokampa šūnās tika novērota ar AMPK saistīta indukcija pa šķietami no mTOR neatkarīgu ceļu. Tāda pati aina bija vērojama dzīvās pelēs, kur metilēnzilā lietošana inducēja makroautofāgijas marķierus smadzeņu garozā un hipokampā.

Indukcija nav pilnībā noritējusi plūsma

Šeit vissvarīgākā ir jēdzienu atšķirība. Indukcija nozīmē, ka procesa sākuma mehānismi veido vairāk autofagosomu. Plūsma nozīmē, ka saturs iziet visu ceļu: norobežošanu, nobriešanu, saplūšanu ar lizosomu, noārdīšanu un pārstrādi. Katrs LC3-II pieaugums pamato apgalvojumu par indukciju, līdz plūsmas pārbaude apstiprina pārējo ceļu.

Standarta plūsmas pārbaudē mēra LC3-II ar īslaicīgu lizosomu darbības bloķēšanu, piemēram, ar bafilomicīnu A1 vai hlorokvīnu, un bez tās. Ja apstrāde patiešām paātrina veidošanos, noārdīšanas bloķēšanai būtu jāpalielina LC3-II daudzums vēl vairāk. Tandēma mCherry-GFP-LC3 reportieris sniedz otru skatpunktu: pirms saplūšanas ar lizosomu struktūras fluorescē dzeltenā krāsā, bet pēc tam, kad skābā vide apslāpē GFP signālu, — tikai sarkanā krāsā. Tādēļ lielāks tikai sarkani fluorescējošu punktveida struktūru skaits liecina par pāreju uz skābām autolizosomām. p62 proteīna daudzuma samazināšanās var papildus apstiprināt satura apriti, taču jāņem vērā, ka pati p62 transkripcija reaģē uz stresu un tā jāpārbauda mRNS līmenī.

Tālāk redzamajā kontrolsarakstā katra šajā literatūrā izmantotā analīzes metode sasaistīta ar to, ko tā mēra un ko tā viena pati nevar pierādīt. Lasītāji to var izmantot, vērtējot jebkuru turpmāku apgalvojumu par makroautofāgiju, tostarp argumentus par badošanos un ilgmūžību, kuros izmantoti šie marķieri.

Pievērsiet uzmanību vienai formulējuma kļūdai, no kuras palīdz izvairīties šī tabula. Fosforilētais ACC ir enzimātiski inhibētā forma. Tā daudzuma pieaugums liecina par AMPK pakārtoto iedarbību, nevis ACC aktivāciju.

Frāze «makroautofāgijas inhibēšana novērsa neiroaizsardzību» prasa tādu pašu precizitāti. HT22 modelī tā nozīmē, ka iejaukšanās autofāgijas un lizosomu ceļā atcēla metilēnzilā sniegto izdzīvošanas priekšrocību seruma trūkuma apstākļos. Tas pamato autofāgijas nepieciešamību vai ieguldījumu šajā šūnu kultūrā. Tas nenosaka autofāgiju kā savienojuma vienīgo aizsargmehānismu un nepierāda, ka hlorokvīns darbojas tikai ar autofāgijas starpniecību; lai nostiprinātu apgalvojumu par cēloņsakarību, būtu nepieciešamas ģenētiskas izmaiņas ATG5, ATG7 vai ULK1.

Divi ceļi uz vienu un to pašu mehānismu

Palīdz vienkāršota shēma. Enerģētiskais stress palielina AMPK aktivitāti, AMPK aktivē ULK1 kompleksu, un autofāgija sākas. Augšanas faktori un barības vielas palielina mTORC1 aktivitāti, mTORC1 inhibē ULK1, un autofāgija paliek neaktīva. Tālāk aiz ULK1 Beclin-1 un VPS34 komplekss aizsāk fagofora veidošanos, LC3-I tiek lipidēts par LC3-II, autofagosoma noslēdzas, saplūst ar lizosomu, un saturs tiek noārdīts, vienlaikus notiekot p62 apritei.

Shēmā katra metilēnzilā atradne novietota attiecīgajā vietā: hipokampa šūnu rezultāts pie AMPK atzara, bet priekštečšūnu rezultāts pie mTOR atzara.

Šāds skatījums atrisina šķietamo neatbilstību ar otro Xie pētījumu. Proliferējošās žurkas neirālajās priekštečšūnās atsevišķā eksperimentā konstatēja, ka 5 μM metilēnzilais inhibēja proliferāciju un veicināja miera stāvokli: Ki67 pozitīvo šūnu skaits samazinājās 1. un 3. dienā, savukārt jau noteiktā diferenciācija neironu virzienā saglabājās. Tur mehānisms darbojās ar nomāktas mTOR signālpārneses starpniecību: samazinājās kopējais mTOR un fosforilētais mTOR, kā arī p70S6K un 4EBP1 ekspresija, turklāt tika samazināta ciklīnu E1, B1, D1 un D2 ekspresija. Dominējošais fenotips bija priekštečšūnu miera stāvoklis, ko autori saistīja ar aizkavētu šūnu novecošanu, nevis stresam pakļautu hipokampa šūnu glābšanu.

Starp abiem rakstiem nav pretrunas. AMPK un mTOR ir no konteksta atkarīgi signālu integratori, nevis nemainīgi slēdži. Stresam pakļauta neironam līdzīga šūna var iesaistīt AMPK bez izmērāmas mTOR inhibēšanas, savukārt mitogēnu stimulēta priekštečšūna uz to pašu savienojumu var reaģēt, ierobežojot no mTOR atkarīgos augšanas mehānismus. Šūnu tips, stresa konteksts, koncentrācija un mērījuma laiks nosaka, kurš atzars dominē. Tāpēc tajā pašā kopainā ietilpst arī metilēnzilā ietekme uz mitohondriju enerģētiku un oksidēšanās–reducēšanās procesiem: kā aprakstīts neiroaizsardzības mehānismu pārskatā, savienojums darbojas kā alternatīvs elektronu pārnesējs, iesaista antioksidatīvo un antiapoptotisko signālpārnesi, inhibē MAO un NOS un ir saistīts ar mitohondriju atjaunošanos ar bioģenēzes un autofāgijas starpniecību. Autofāgija ir viens daudzveidīgās iedarbības atzars, nevis viss skaidrojums.

Ko eksperimenti neparāda

Seruma atņemšana modelē trofisko un vielmaiņas stresu šūnu kultūrā. Tā nemodelē visa organisma badošanos: glikoze, aminoskābes un sāļi paliek pamata barotnē, un nav nekādas barošanās uzvedības. Kultūrā izmantotās koncentrācijas no 20 nM līdz 5 μM nevar ar aritmētisku pārrēķinu pārvērst devās cilvēkiem, jo atšķiras uzsūkšanās, saistīšanās ar proteīniem, oksidēšanās–reducēšanās stāvoklis, vielmaiņa, uzkrāšanās audos un iedarbības ilgums.

Nav izstrādāts neviens pētījums ar cilvēkiem, kura mērķis būtu pierādīt metilēnzilā inducētu autofāgisko plūsmu pacientiem. Mehānistiskie pierādījumi joprojām aprobežojas ar šūnu, ex vivo un dzīvnieku pētījumiem, un pārskatos pierādījumi par pārnesi uz klīnisko praksi joprojām raksturoti kā sākotnēji. Tātad šie pētījumi neparāda, ka metilēnzilais atdarina badošanos, pagarina cilvēka mūžu ar autofāgijas starpniecību vai nodrošina pilnīgu autofāgiskās plūsmas norisi cilvēka smadzenēs. Apgalvojumiem par badošanās atdarināšanu un ilgmūžību vajadzīgi atsevišķi klīniski pierādījumi, un metilēnzilā pētījumi ar cilvēkiem citu indikāciju gadījumā nekļūst par autofāgijas pētījumiem tikai saistības dēļ. Pētījumi par barības vielu trūkuma radīta stresa un ilgmūžības modeļiem jālasa, ievērojot šo robežu.

Lasot nākamo rakstu, izmantojiet kontrolsarakstu secīgi. Vispirms jautājiet, kurš atzars mainījās: AMPK, mTOR vai neviens no tiem. Pēc tam noskaidrojiet, vai LC3 rezultāts tika papildināts ar plūsmas pārbaudi vai arī ir vienīgais rādītājs. Tad pārbaudiet, vai ceļa bloķēšana atcēla labvēlīgo ietekmi un ar kādu metodi tas tika panākts. Pētījums, kas atbild uz visiem trim jautājumiem, pamato spēcīgu apgalvojumu par mehānismu. Pētījums, kas atbild tikai uz pirmo, ir parādījis atļaujošu signālu, bet pārējais ceļš joprojām nav izpētīts.