Metilēnzilais un smadzeņu balsta šūnas: astrocīti, mikroglija un iekaisums

Pieņemsim, ka veicat divus eksperimentus ar vienu un to pašu zilo krāsvielu un iegūstat divus daudzsološus rezultātus. Vienā kultūras traukā zvaigžņveida balsta šūnas izdzīvo skābekļa un glikozes trūkuma apstākļos. Otrā smadzeņu imūnšūnas saglabā savu mierīgo, sazaroto formu, neraugoties uz baktēriju toksīnu. Ir vilinoši apvienot abus rezultātus vienā apgalvojumā: krāsviela mazina smadzeņu iekaisumu un aizsargā smadzenes. Tieši šajā apvienošanas brīdī uzmanīgam lasītājam vajadzētu apstāties un padomāt.

Smadzenēs ir divas balsta šūnu populācijas ar atšķirīgiem uzdevumiem, un metilēnzilā ietekme uz katru no tām tiek pētīta ar atšķirīgu eksperimentālu ierosinātāju. Astrocīti nodrošina vielmaiņas atbalstu. Tie atrodas starp asinsvadiem un neironiem, aizvāc lieko glutamātu, stabilizē kālija līmeni, uzkrāj glikogēnu un piegādā neironiem enerģijas avotus, kad pieprasījums strauji pieaug. Mikroglijas šūnas ir audos pastāvīgi esošie imūnie uzraugi. To smalkie izaugumi pārrauga audus un uztver baktēriju un bojājumu signālus. Trauksmes gadījumā šūnas ievelk izaugumus, iegūstot noapaļotu, amēbveida formu, kas piemērota migrācijai un materiāla aprīšanai, un vienlaikus izdala signālmolekulas. Vienā populācijā iegūtu rezultātu nevar pārnest uz otru, un katrā gadījumā izmantotais mērījums nosaka, kas patiesībā ir parādīts.

Astrocīti metaboliskā stresa apstākļos: galvenais rezultāts ir ievadīšanas laiks

Eksperiments ar astrocītiem sākas ar skābekļa un glikozes atņemšanu. Pētnieki kultivēja jaundzimušu peļu smadzeņu garozas astrocītus, uz sešām stundām atņēma tiem glikozi un gandrīz visu skābekli, pēc tam atjaunoja abus uz divdesmit četrām stundām. Tas ir insulta un tam sekojošas reperfūzijas laboratorijas modelis. Ja metilēnzilais bija klātesošs skābekļa un glikozes trūkuma fāzē, šūnu izdzīvošana pasliktinājās. Ja to pievienoja tikai reoksigenācijas fāzē 0.1 un 1 mikromolārā koncentrācijā, šūnu izdzīvošana, ko noteica ar kalceīna dzīvotspējas testu, būtiski uzlabojās. Pētījumā ar peļu astrocītiem šī atšķirība atkarībā no ievadīšanas laika aprakstīta kopā ar šūnu elpošanas datiem.

Tieši šī atšķirība ir svarīgākais atklājums. Trūkuma fāzē gandrīz nav skābekļa, kas varētu pieņemt elektronus, tāpēc elektronu pārneses mehānismam nav kur tos nogādāt. Reoksigenācijas laikā šūnu mehānismi atsāk darboties, un krāsvielai rodas iespēja iesaistīties. Ar metilēnzilo apstrādātie astrocīti patērēja vairāk skābekļa, uzņēma vairāk glikozes, saražoja vairāk ATP un atjaunoja glikogēna krājumus; heksokināzes aktivitāte bija augstāka, bet mitohondriju superoksīda līmenis nepieauga. Piedāvātais skaidrojums ir jau pazīstamais no apraksta par metilēnzilo kā mitohondriju elektronu nesēju: tas pārnes elektronus garām bloķētiem posmiem elpošanas ķēdē, ļaujot elpošanai atsākties bez elektronu noplūdes, kas veidotu reaktīvas daļiņas.

Pievērsiet uzmanību tam, kāda veida pierādījumi tie ir. Tas ir izdzīvošanas un vielmaiņas rezultāts vienā izolētā šūnu veidā ar noteiktu efektīvas iedarbības laika logu — atjaunošanās, nevis trūkuma fāzi — un noteiktu koncentrāciju diapazonu. Tas neko nepasaka par imūno signalizāciju un neko par uzvedību.

Mikroglija baktēriju izraisītas trauksmes apstākļos: pārprogrammēta vielmaiņa

Eksperimenti ar mikrogliju sākas ar pretēju ierosinātāju — nevis barības vielu trūkumu, bet viltus infekciju. Lipopolisaharīds, baktēriju ārējās membrānas fragments, saistās ar iedzimtās imunitātes sensoriem un liek mikroglijai reaģēt tā, it kā būtu ieradušies patogēni, lai gan dzīvu baktēriju nav. Pelēm, kurām ievadīts lipopolisaharīds, un kultivētā mikroglijas šūnu līnijā rezultāts ir pazīstama iekaisuma programma: pieaug iekaisumu veicinošu faktoru līmenis, mikroglija polarizējas uz agresīvo M1 stāvokli, blakus esošie neironi iet bojā, un dzīvniekiem pasliktinās mācīšanās un atmiņas uzdevumu rezultāti.

Pētījumā ar pelēm šī reakcija saistīta ar skābekļa uztveres signālceļu: lipopolisaharīds caur augšupējā signālceļa Siah2/Morg1 ķēdi izraisa PHD3 — viena no trim prolilhidroksilāzes enzīmiem — pārmērīgu ekspresiju. Vienlaikus šūnas pārprogrammē enerģijas izmantošanu par labu aerobajai glikolīzei, palielinoties mitohondriju reaktīvo skābekļa formu līmenim. Autori šo pāreju tieši izmērīja ar Seahorse vielmaiņas testiem, nosakot skābekļa patēriņu un ārpusšūnu vides paskābināšanos. Metilēnzilais novērsa gan vielmaiņas pārmaiņas, gan PHD3 pārmērīgo ekspresiju, pazemināja iekaisuma faktoru līmeni, samazināja neironu bojāeju un uzlaboja uzvedības testu rezultātus. Pozitronu emisijas tomogrāfija papildināja pierādījumus ar attēldiagnostikas datiem: lipopolisaharīds palielināja glikozes uzņemšanu hipokampā FDG-PET izmeklējumā, bet pēc metilēnzilā ievadīšanas tā atkal samazinājās. Tas atbilst mazāk aktīvai ar iekaisumu saistītai vielmaiņai dzīva organisma smadzenēs.

Šis mērījumu kopums ir plašāks nekā astrocītu pētījumā — citokīni, vielmaiņa, attēldiagnostika un dzīvnieku uzvedība —, tomēr tas attiecas uz citu ierosinātāju un citu šūnu veidu. Salīdzinot abus pētījumus, lasītājiem šie ierosinātāji jānošķir: viens pētījums parāda barības vielu trūkuma skartu balsta šūnu glābšanu atjaunošanās laikā, otrs — viltus infekcijas trauksmes slāpēšanu imūnšūnās.

Mikroglija zem mikroskopa: forma kā rādītājs

Trešais eksperiments aplūko to pašu baktēriju izraisīto trauksmi tikai caur šūnu formu. Žurku smadzeņu garozas glijas kultūrās kontroles mikroglijas šūnām, kas iekrāsotas ar IBA1 marķieri, redzami daudzi smalki izaugumi — sazarotā audu uzraudzības forma. Pēc divdesmit četrām stundām lipopolisaharīda iedarbības 10 mikrogramu mililitrā koncentrācijā šūnas saplok un iegūst amēbveida formu. To šūnas ķermeņa laukums palielinās, bet perimetrs paliek aptuveni nemainīgs, kas ģeometriski raksturo noapaļošanos. Metilēnzilais 1 mikromolārā koncentrācijā, kas pievienots vienlaikus ar toksīnu, saglabāja sazarotos izaugumus un noturēja šūnas ķermeņa laukumu un perimetru tuvu kontroles vērtībām. Pētījumā ar žurku šūnu kultūru šo formas saglabāšanu kvantitatīvi novērtē ar šūnas ķermeņa laukuma un perimetra mērījumiem.

Divas detaļas padara šo pētījumu nozīmīgāku par vienkāršu attēlu. Pirmkārt, salīdzināšanai izmantotais savienojums menadions — cita redoksaktīva molekula tādā pašā koncentrācijā — nesaglabāja šūnu formu un pats par sevi virzīja šūnas uz aktivēto formu. Tātad šī ietekme nav vispārīga visu redoksciklā iesaistīto vielu īpašība. Otrkārt, autori krāsvielas ietekmi saista ar Nrf2 aktivāciju — transkripcijas faktora vadītu programmu, kas regulē antioksidatīvos un pretiekaisuma gēnus —, nevis tikai ar reaktīvo daļiņu tiešu neitralizēšanu. Saistītie redoksprocesu un iekaisuma signalizācijas apskati palīdz šo saikni ar Nrf2 ievietot plašākā kontekstā.

Tomēr forma sniedz visierobežotāko informāciju no šiem trim rādītājiem. Sazarota šūna parasti ir audus uzraugoša šūna, bet noapaļota šūna parasti ir aktivēta. Taču morfoloģija ir netiešs rādītājs, nevis gēnu transkripcijas aina. Šajā kultūrā nebija ne ar asinīm ienākušu imūnšūnu, ne neironu ķēžu, ne uzvedības izpausmju.

Triju rezultātu salīdzinājums

Visām tabulas rindām kopīgs ir tas, ka katram ierosinātājam ir savs mērījums un sava atbilde. Vielmaiņas atjaunošana atbild uz jautājumu par vielmaiņu. Citokīnu un uzvedības dati atbild uz jautājumu par iekaisumu. Forma atbild uz jautājumu par formu. Neviens no šiem trim rezultātiem pats par sevi nav pārnesams uz pārējiem.

Ko nepierāda mierīgāka izskata mikroglija

Visai šai tēmai ir vajadzīgs šāds teikums: mikroglija, kas izskatās mazāk aktivēta, vai izmainīta mikroglijas vielmaiņa pati par sevi nepierāda uzlabotu smadzeņu darbību.

Morfoloģija var mainīties, funkcijai nemainoties. Šūna var saglabāt savus zarus un joprojām izdalīt citokīnus, vai arī noapaļoties, vienlaikus lietderīgi aizvācot šūnu atliekas. Vielmaiņas mērījumiem ir tāds pats ierobežojums: Seahorse līkne vai PET izmeklējums parāda enerģijas izmantošanu, nevis izziņas spējas. Pētījums ar pelēm, kurā vielmaiņas un ar formu saistītie rādītāji apvienoti ar uzvedības testiem, ir pārliecinošāks tieši tāpēc, ka tajā apvienoti vairāki pierādījumu līmeņi, nevis vienam mērījumam uzlikts pienākums pamatot visu secinājumu. Arī tur saglabājas ierastie ierobežojumi: lipopolisaharīds modelē sterilu trauksmes reakciju, nevis īstu infekciju, peles nav cilvēki, un paši autori norāda uz atšķirībām starp sugām. Ikvienam, kurš plāno turpmākus pētījumus, būtu jāizvērtē, cik pārnesami ir mikroglijas pētījumu atklājumi starp dažādiem modeļiem, pirms pieņemt, ka šis signālceļš cilvēka audos darbojas identiski.

No tā izriet praktisks secinājums par ievadīšanas laiku. Astrocītu pētījumā agrīna ievadīšana pasliktina rezultātu, bet ievadīšana atjaunošanās laikā to uzlabo. Mikroglijas pētījumu rezultāti iegūti, ievadot vielu ap iekaisuma ierosināšanas brīdi. Reālajā dzīvē smadzeņu bojājums vienlaikus apvieno abas fāzes: enerģijas nodrošinājuma traucējumus un imūno trauksmi, kas attīstās vairāku stundu laikā. Eksperiments, kas izolē vienu fāzi, nevar noteikt ievadīšanas grafiku situācijai, kurā abas ir apvienotas. Tāpēc diskusijās par ievadīšanas laika logiem skābekļa un glikozes trūkuma un iekaisuma norises laika gaitā aplūko atsevišķi.

Godīgs kopsavilkums ietilpst vienā rindkopā. Izolētos astrocītos reoksigenācijas laikā pievienots metilēnzilais atjauno elpošanu un pasargā šūnas no bojāejas. Mikroglijā, kas pakļauta baktēriju fragmenta iedarbībai, tas caur konkrētu PHD3 signālceļu novērš ar iekaisumu saistītu vielmaiņas programmu un saglabā miera stāvokļa formu. Katrs rezultāts ir īsts sava eksperimenta ietvaros, un neviens no tiem nav vispārīgs spriedums par smadzeņu iekaisumu. Glijas šūnu salīdzinājums ir noderīgs tieši tāpēc, ka tas neļauj abiem stāstiem saplūst vienā.