Vienkāršā krāsošana ar metilēnzilo un krāsošana pēc Grama: ko katra metode var pierādīt

Students sagatavo uztriepi no kultūras ar marķējumu E. coli, uz vienu minūti pārklāj to ar metilēnzilo, noskalo un aplūko ar eļļas imersijas objektīvu. Redzeslauku klāj zilas nūjiņas. Laboratorijas pārskatā rakstīts: "Gramnegatīvas nūjiņas, identificētas kā E. coli." Novērojums ir pareizs. Taču šis preparāts nedod pamatu šādam secinājumam.

Kļūda ir konceptuāla, nevis tehniska. Students uztvēra vienkāršo krāsošanu tā, it kā tā būtu diferenciāla pārbaude. Vienkāršā krāsošana un krāsošana pēc Grama atbild uz dažādiem jautājumiem, jo to pamatā ir atšķirīgi krāsošanas principi. Viena noskaidro, kāda forma ir redzama. Otra noskaidro, kā šūnapvalks uzvedas pārbaudes apstākļos. Sajaucot abas metodes, pareizi nokrāsots preparāts kļūst par pamatu nepamatotam pārskatam.

Šajā salīdzinājumā abas metodes ir skaidri nošķirtas, parādīts, kādus apgalvojumus ļauj izteikt katrs rezultāts, un sniegtas atbildes uz diviem studentu biežāk uzdotajiem jautājumiem: vai metilēnzilo var izmantot krāsošanā pēc Grama un ko patiesībā parāda E. coli krāsošana ar metilēnzilo.

Īsā atbilde

Vienkāršā krāsošana ar metilēnzilo iekrāso visas krāsojamās šūnas vienādi zilas, tāpēc tā atklāj morfoloģiju (nūjiņas, lodītes, spirāles) un izkārtojumu (atsevišķi, pāros, ķēdēs), bet neko nepasaka par Grama kategoriju. Krāsošana pēc Grama papildus ietver jodu, atkrāsošanas posmu un kontrastkrāsošanu, tāpēc tā nošķir baktērijas grampozitīvās (violetās) un gramnegatīvās (rozā vai sarkanās) atkarībā no tā, kā to apvalki saglabā krāsvielu. Zilas nūjiņas pēc krāsošanas ar metilēnzilo nozīmē: "Ir redzamas nūjiņveida šūnas." Rozā nūjiņas pēc pilnas krāsošanas pēc Grama secības nozīmē: "Ir redzamas gramnegatīvas nūjiņas." Otrais apgalvojums ir pamatotāks, jo procedūrā veikta papildu pārbaude.

Plašāku pārskatu par vienas krāsvielas baktēriju krāsošanas metodēm, kurām veltīts arī šis raksts, skatiet mikroskopiskās krāsošanas atlantā.

Vienkāršā krāsošana: viena krāsviela, viens jautājums

Metilēnzilais ir bāziska (katjoniska) krāsviela. Tā krāsainajam jonam ir pozitīvs lādiņš, un tas saistās ar negatīvi lādētām šūnas struktūrām, tostarp nukleīnskābēm un skābām virsmas grupām, tāpēc uz gaiša fona šūnas izskatās zilas. OpenStax šo pozitīvās krāsošanas principu apraksta nodaļā par krāsošanu. Pats krāsvielas katjons ir neliels, plakans fenotiazīna jons, kas detalizēti aprakstīts metilēnzilā ķīmijas uzziņu rakstā; hlorīda pretjons krāsošanā nepiedalās.

Standarta mācību protokols ir apzināti vienkāršs: sagatavot plānu uztriepi, izžāvēt gaisā, fiksēt karsējot, aptuveni uz vienu minūti pārklāt ar apmēram 1% metilēnzilā ūdens šķīdumu, saudzīgi noskalot ar ūdeni, nosusināt un aplūkot ar eļļas imersiju. LibreTexts mācību protokolā norādīts tieši šāds 1% šķīdums un vienas minūtes krāsošana, vienlaikus atzīmējot, ka dažās laboratorijās krāsošanas laiku pagarina. Nav kodinātāja, nav atkrāsotāja, nav otras krāsvielas. Šis trūkums ir būtisks. Izmantojot tikai vienu krāsvielu bez selektīvas atkrāsošanas, visas šūnas, kas saista krāsvielu, iegūst vienādu krāsu.

E. coli gadījumā sagaidāmais redzeslauks ir zilas nūjiņas (baciļi), kas izvietotas atsevišķi, pāros vai nelielās grupās. Zilo krāsu dod krāsviela. Nūjiņveida forma ir organisma īpašība. Taču šī kombinācija neļauj identificēt organismu, jo daudzām sugām ir nūjiņveida forma un daudzas nūjiņas vienkāršajā krāsošanā iekrāsojas zilas. ATCC savā mikrobioloģisko kultūru rokasgrāmatā skaidri norāda, ka šī metode ļauj spriest tikai par morfoloģiju. Pareizs ieraksts pārskatā ir: "Novēroti zili baciļi." Jebkuram apgalvojumam, kas pārsniedz formu un izkārtojumu, vajadzīgi papildu pierādījumi.

Krāsošana pēc Grama: četri reaģenti, viena uzvedības pārbaude

Krāsošana pēc Grama ir diferenciāla krāsošana. Visas šūnas tiek pakļautas vienai un tai pašai darbību secībai, un tiek novērots, kuras šūnas saglabā pirmo krāsvielu un kuras to zaudē. Amerikas Mikrobioloģijas biedrības krāsošanas pēc Grama protokolos noteikta standarta četru posmu secība: kristālvioletais (primārā krāsviela), Grama joda šķīdums (kodinātājs), spirts vai acetona un spirta maisījums (atkrāsotājs), pēc tam safranīns (kontrastkrāsviela).

Standarta mācību modelis šo atšķirību skaidro ar apvalka uzbūvi. Grampozitīvām šūnām ir biezs peptidoglikāna šūnapvalks, kas skalošanas laikā ar spirtu dehidratējas un saglabā kristālvioletā un joda kompleksu. Gramnegatīvām šūnām ir plāns peptidoglikāna slānis un ar lipīdiem bagāta ārējā membrāna, kuru atkrāsotājs izjauc, tāpēc komplekss izskalojas un šūnas pēc tam uzņem safranīnu. NCBI Bookshelf pārskatā par krāsošanu pēc Grama sniegts šis skaidrojums par šūnapvalku. Speciālisti piebilst, ka procesa pilnā fizikālā ķīmija ir sarežģītāka un nav atkarīga tikai no šūnapvalka biezuma, taču laboratorijas interpretācijā uzvedības princips paliek spēkā: violeta krāsa nozīmē, ka krāsviela ir saglabāta, bet rozā — ka tā zaudēta un pēc tam veikta kontrastkrāsošana.

Ilustratīvi attēli. Stilizēti zīmējumi metožu salīdzināšanai, nevis ar kameru uzņemtas mikrofotogrāfijas. Krāsas ir vienkāršotas, lai izskaidrotu principu: viena krāsa vienkāršajā krāsošanā, divas krāsas pēc atkrāsošanas Grama metodē.

Vai metilēnzilo var izmantot krāsošanā pēc Grama

Šo jautājumu var saprast divējādi, un katrā gadījumā atbilde ir atšķirīga.

Pirmais jautājuma variants: vai vienreizēja pārklāšana ar metilēnzilo var aizstāt visu krāsošanas pēc Grama secību. Nē. Bez joda, atkrāsotāja un kontrastkrāsvielas nav diferenciāla posma, tāpēc Grama kategorija netiek pārbaudīta. Zils redzeslauks pēc krāsošanas tikai ar metilēnzilo ir vienkāršās krāsošanas rezultāts, pat ja pudelīte stāv blakus Grama metodes reaģentiem. Neierakstiet to kā krāsošanas pēc Grama rezultātu.

Otrais jautājuma variants: vai metilēnzilais var aizstāt safranīnu kā kontrastkrāsviela 4. posmā. Funkcionāli tas var iekrāsot atkrāsotās šūnas, un mācību uzdevumā pēc šādas aizstāšanas sagaidāmas violetas grampozitīvas šūnas un zilas gramnegatīvas šūnas. Šī loģika ir pamatota, jo pareizi atkrāsotas gramnegatīvas šūnas ir gandrīz bezkrāsainas un uzņems citu katjonisku krāsvielu. Taču tas nav standarta protokols. ASM protokolos norādīts safranīns, un dažos variantos atzītas alternatīvas, piemēram, bāziskais fuksīns, nevis metilēnzilais. Pastāv arī praktisks trūkums: zilo krāsu ir grūtāk atšķirt no violetās nekā rozā no violetās, īpaši iesācējiem un īpaši ar nolietotām mikroskopa lampām. Mācību darbā un jebkurā gadījumā, kad rezultātam ir nozīme, izmantojiet protokolā norādīto kontrastkrāsvielu, parasti safranīnu, un uzskatiet kontrastkrāsošanu ar metilēnzilo par demonstrācijas variantu, nevis līdzvērtīgu standarta metodi.

Saistītais jautājums par to, kā metilēnzilais salīdzināms ar citām vienas krāsvielas metodēm, ir aplūkots vienkāršo baktēriju krāsošanas metožu salīdzinājumā.

Ko pierāda E. coli krāsošana ar metilēnzilo un ko tā nepierāda

E. coli ir gramnegatīva nūjiņa, taču šajā teikumā apvienoti fakti, kas iegūti ar vairākām metodēm: morfoloģija — ar mikroskopiju, Grama reakcija — ar krāsošanu pēc Grama, identitāte — ar kultivēšanu un bioķīmiskām vai molekulārām pārbaudēm. Ar metilēnzilo krāsota uztriepe sniedz tikai pirmo informācijas daļu. Tā parāda, ka krāsotajā paraugā ir nūjiņveida šūnas un kā tās ir izkārtotas. Tā nenosaka Grama reakciju, jo atkrāsošanas pārbaude nav veikta. Tā nenosaka sugu, jo šādā izšķirtspējā daudzu sugu nūjiņas izskatās līdzīgi.

Tieši šajā vietā pārskatos rodas paredzama kļūda. Autors novērojuma ierakstā iekļauj iepriekš zināmo informāciju ("šai kultūrai vajadzētu būt E. coli, un E. coli ir gramnegatīva"), tāpēc šķiet, ka preparāts apstiprina to, kas patiesībā tikai pieņemts. Precīzākā pārskatā šie informācijas līmeņi ir nošķirti: "Vienkāršā krāsošana ar metilēnzilo: novēroti zili baciļi; novērtēta tikai morfoloģija, Grama kategorija nav pārbaudīta." Pēc tam, ja krāsošana pēc Grama veikta pareizi un ar kontrolēm: "Krāsošana pēc Grama: rozā nūjiņas, kas atbilst gramnegatīvai reakcijai." Sugas identitāti nosaka vēlāk identifikācijas procesā, nevis tikai pēc krāsas.

Praktiska interpretācijas rokasgrāmata

Laboratorijā izmantojiet šādu lēmuma principu. Ja visas šūnas ir vienā krāsā un protokolā izmantota viena krāsviela bez atkrāsotāja, esat veicis vienkāršo krāsošanu. Norādiet formu, aptuveno izmēru un izkārtojumu. Ar to arī apstājieties. Ja protokolā izmantots kristālvioletais, jods, atkrāsotājs un kontrastkrāsviela kopā ar zināmām pozitīvām un negatīvām kontrolēm, esat veicis krāsošanu pēc Grama. Norādiet krāsu un morfoloģiju: violeti koki ķēdēs, rozā nūjiņas un tā tālāk.

Lielāko daļu neskaidrību rada trīs kļūdas. Pirmā — nepamatoti uztvert zilas nūjiņas kā E. coli apstiprinājumu. Otrā — ierakstīt metilēnzilā preparāta rezultātu laboratorijas pierakstos zem virsraksta "Krāsošana pēc Grama", tādējādi maldinot vēlākos lasītājus. Trešā — nepārdomāti mainīt kontrastkrāsvielas un pēc tam salīdzināt krāsas dažādās laboratorijās tā, it kā izmantotās krāsu paletes būtu vienādas. Visām šīm kļūdām ir viens risinājums: nosauciet faktiski izmantoto metodi un apgalvojiet tikai to, ko šī metode pārbauda.

Vienkāršā krāsošana ir noderīga tieši tāpēc, ka tās secinājumu tvērums ir šaurs. Tā ir ātra, mazāk jutīga pret nelielām procedūras novirzēm un pietiekama, ja jautājums ir par morfoloģiju: vai kaut kas ir redzams un kāda ir tā forma. Ja jautājums ir par klasifikāciju, veiciet diferenciālo pārbaudi. Zilais preparāts parāda, kā šūnas izskatās. Violetais vai rozā preparāts parāda, kā uzvedas to šūnapvalki. Neviens no šiem preparātiem pats par sevi nenosaka sugu.