Metilēnzilā ietekmes uz mitohondrijiem mērīšana: skābeklis, ATP un membrānas potenciāls

Pieņemsim, ka laboratorijā mitohondrijiem ar traucētu elpošanu pievieno metilēnzilo un novēro skābekļa patēriņa pieaugumu. Dabiski būtu rakstīt, ka krāsviela atjaunoja mitohondriju darbību. Šis apgalvojums var būt kļūdains. Skābekļa plūsma, ATP sintēze un membrānas potenciāls ir trīs atšķirīgi jēdzieni. Tie attiecas uz vienu un to pašu organellu tāpat, kā dublēšana, sinhronizācija un koplietošana attiecas uz vienu mākoņkrātuves mapi: tie ir saistīti, taču katru nosaka atšķirīgi principi. Sajaucot vienu ar otru, interpretācija kļūst kļūdaina, pat ja katrs mērījums ir tehniski pareizs.

Metilēnzilais palielina šādas sajaukšanas iespēju, jo tas pats piedalās sistēmā, kuru mēra. Tas ir redoksciklu dalībnieks, kas pieņem elektronus ķēdes agrākos posmos un nodod tos tālākos posmos, lipofils katjons, kas uzkrājas enerģizētos mitohondrijos, un intensīvi zils savienojums, kas absorbē un izstaro gaismu tajās pašās joslās, kurās darbojas izplatītas zondes. Viens rādījums nevar sniegt visu nepieciešamo informāciju. Uzticamā pieeja, kas izmantota Budapeštas mitohondriju pētījumos, ir mērīt skābekļa plūsmu kopā ar ATP sintēzes ātrumu, membrānas potenciālu un ūdeņraža peroksīda izdalīšanos, katrā posmā izmantojot krāsvielai specifiskas kontroles.

Respirometrija mēra skābekļa plūsmu, nevis enerģijas iznākumu

Augstas izšķirtspējas respirometrija — neatkarīgi no tā, vai izmanto Oroboros Oxygraph vai Seahorse ekstracelulārās plūsmas analizatoru, — parāda vienu: cik ātri tiek reducēts skābeklis. Tā neparāda, cik protonu tika pārsūknēts uz vienu elektronu, cik liela gradienta daļa tika saglabāta vai vai ATP sintāze to izmantoja.

Terminoloģijai ir nozīme. Izolētos mitohondrijos substrāts bez ADP nodrošina noplūdes elpošanu, substrāts ar piesātinošu ADP daudzumu parāda oksidatīvās fosforilēšanas kapacitāti, bet atjūdzēja titrēšana parāda maksimālo elektronu pārneses kapacitāti. Neskartās šūnās Seahorse ekvivalenti ir bazālā elpošana, pret oligomicīnu jutīgā ar ATP saistītā elpošana, protonu noplūde, ar FCCP noteiktā maksimālā elpošana un pret rotenonu un antimicīnu rezistentais nemitohondriālais skābekļa patēriņš. Seahorse rādījumu dēvēšana par State 3 un State 4 piedēvē tiem precizitāti, ko šāds preparāts neļauj nodrošināt, kā skaidri norādīts Agilent Mito Stress Test metodiskajā ietvarā.

Metilēnzilais izjauc intuitīvo saikni starp lielāku skābekļa patēriņu un lielāku enerģijas ieguvi. Izolētos jūrascūciņu smadzeņu mitohondrijos krāsviela koncentrācijā no 100 nM līdz 1 uM palielināja skābekļa patēriņu miera stāvoklī, izmantojot glutamātu kopā ar malātu, sukcinātu un alfa-glicerofosfātu kā substrātus; ar alfa-glicerofosfātu pieaugums bija aptuveni 64 procenti. Tomēr ADP stimulētā elpošana veselos mitohondrijos būtībā nemainījās, kā norādīts izolētu smadzeņu mitohondriju pētījumā. Tā kā noplūde palielinājās, bet ADP stimulētā plūsma nemainījās, aprēķinātais elpošanas kontroles koeficients samazinās. Šis samazinājums nenozīmē, ka krāsviela bojāja mitohondrijus. Tas nozīmē, ka krāsviela papildus normālajai elpošanai ieviesa skābekli patērējošu redoksciklu. Metilēnzilā skābekļa patēriņa analīze, kurā ziņo tikai par pieaugumu, ir izmērījusi reālu ķīmisku procesu, bet neko nav pateikusi par enerģijas saglabāšanu.

Darbības atjaunošanas eksperimenti parāda to pašu neatbilstību lielākā mērogā. Bloķējot I kompleksu, skābekļa plūsma atjaunojās aptuveni trīskārt, bet ATP sintēze — tikai aptuveni 1.5 reizes. Vairāk skābekļa sasniedza elektrodu. Mazāka tā daļa nodrošināja ATP veidošanos. Jebkuram apgalvojumam par uzlabotu oksidatīvo fosforilēšanu nepieciešami arī ATP dati, vēlams izteikti kā ATP un skābekļa attiecība, norādot, kā definēts saucējs.

ATP analīzes mēra sintēzes ātrumu, ko kopējais daudzums nevar aizstāt

ATP analīze atbild uz citu jautājumu: cik daudz ATP rodas laika vienībā. Kinētisks mērījums — vai nu jāņtārpiņu luciferāzes luminiscences novērošana vairāku minūšu laikā, vai saistīta heksokināzes un glikozes-6-fosfāta dehidrogenāzes analīze ar nolasīšanu pie 340 nm — ļauj noteikt ātrumu. Viens kopējā ATP galapunkta mērījums parāda daudzumu, kas atspoguļo sintēzes un patēriņa starpību un pats par sevi maz ko pasaka par oksidatīvo fosforilēšanu.

Budapeštas grupa izmantoja saistīto enzimātisko metodi ar nomāktu adenilātkināzes aktivitāti un konstatēja, ka metilēnzilais koncentrācijā no 1 līdz 2 uM mēreni, bet statistiski nozīmīgi palielināja ATP veidošanos ar rotenonu un ar antimicīnu apstrādātos mitohondrijos. Tā ir īsta, bet daļēja darbības atjaunošana. TEGDMA toksicitātes pētījumā citā modelī tika iegūts līdzīgs rezultāts: 5 mM zobārstniecības monomēra TEGDMA samazināja ar I kompleksu saistīto elpošanu no aptuveni 286 līdz 28 plūsmas vienībām, un 2 uM krāsvielas to atjaunoja līdz aptuveni 86.

Strādājot ar krāsainu redoksaktīvu savienojumu, divas kontroles ir obligātas. Pirmkārt, izmantojiet oligomicīnu, lai noteiktu, kāda izmērītās ATP sintēzes daļa ir atkarīga no ATP sintāzes. Otrkārt, veiciet pievienotā ATP atgūšanas pārbaudi bezšūnu sistēmā ar zināmu ATP daudzumu, pilnu reaģentu sastāvu un tieši tām krāsvielas koncentrācijām, kuras izmantotas eksperimentā — vismaz 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM un 2 uM. Krāsviela var absorbēt izstaroto gaismu, inhibēt reportierenzīmu vai mainīt reaģentu redoksķīmiju, un vispārīgās luciferāzes analīžu vadlīnijas tieši šāda veida traucējumiem iesaka bioķīmiskas papildu pārbaudes. Neuzskatiet, ka 1 uM koncentrācijā artefaktu nav tikai tāpēc, ka dzēšana parasti ir izteiktāka augstākās koncentrācijās.

Membrānas potenciāla zondes mēra krāsvielas sadalījumu, nevis plūsmu

Safranīns O, TMRM un TMRE, rodamīns 123 un JC-1 ir membrānu caurlaidīgi katjoni. Tie uzkrājas negatīvi lādētajā matriksā atbilstoši elektroķīmiskajam līdzsvaram, tāpēc kopējā fluorescence netieši parāda potenciālu caur zondes atrašanās vietu. Neviena no šīm zondēm nemēra ATP vai elektronu plūsmu.

Katra zonde ir piemērotāka noteiktam preparātam. Safranīns O ir piemērots izolētiem mitohondrijiem un permeabilizētām šūnām, parasti aptuveni 2 uM koncentrācijā ar ierosmi ap 495 nm un emisiju ap 585 nm, darbojoties dzēšanas režīmā, kur uzņemšana maina kopējo fluorescenci. TMRM un TMRE ir piemēroti neskartām šūnām pie zemām nanomolārām zondes koncentrācijām nedzēšanas režīmā, kur depolarizācija izraisa krāsvielas izdalīšanos un mitohondriju fluorescences samazināšanos; pie lielas zondes uzņemšanas pašdzēšanas dēļ signāla virziens var apgriezties. JC-1 nodrošina ērtu zaļās un sarkanās fluorescences attiecību, taču tā ir atkarīga no zondes uzņemšanas un mitohondriju masas, tāpēc kvantitatīvam darbam ir mazāk piemērota nekā rūpīgi kontrolēts TMRM. Šie kompromisi apkopoti plaši izmantotā mitohondriju membrānas potenciāla zonžu pārskatā.

Metilēnzilais rada optiskus traucējumus tieši darba koncentrācijās. Tā absorbcijas joslas ap 600 līdz 665 nm pārklājas ar sarkano zonžu emisiju, tāpēc iekšējā filtra efekti, dzēšana un ierosmes gaismas absorbcija ir ticami traucējumu avoti. Krāsviela ir arī otrs lipofils katjons, kura sadalījums mainās atkarībā no mērāmā potenciāla. Aizsardzība pret šiem traucējumiem ir mērījumu dublēšana un tukšie paraugi: tikai zonde, tikai krāsviela, zonde kopā ar katru krāsvielas koncentrāciju, pilnīga depolarizācija ar FCCP kā nulles atskaites punkts un, ideālā gadījumā, otra optiski atšķirīga zonde. III kompleksa apiešanas pētījums radīja šādu precedentu, atkārtojot membrānas potenciāla atjaunošanas mērījumus gan ar safranīnu O, gan ar TMRM pēc inhibēšanas ar antimicīnu un miksotiazolu un iegūstot tādu pašu kvalitatīvu atjaunošanos. Viens optiskais reporters ir norāde. Divi neatkarīgi reporteri ir pierādījums.

Trīs preparāti, trīs atšķirīgi jautājumi

Izolēti mitohondriji, permeabilizētas šūnas un neskartas šūnas nav savstarpēji aizvietojami vienas analīzes jutības iestatījumi. Tās ir atšķirīgas pieejas ar atšķirīgiem darbības principiem.

Izolēti mitohondriji saglabā elektronu transporta ķēdi, iekšējo membrānu un matriksa funkcionālo aparātu, bet ir atdalīti no plazmatiskās membrānas, citosola un tīkla arhitektūras. Šī atdalīšana arī ir mērķis: substrātu, ADP, inhibitoru un krāsvielas koncentrācijas ir precīzi noteiktas, tāpēc var identificēt konkrētu ceļu. Cena ir dabiskās substrātu piegādes, signalizācijas un enerģijas pieprasījuma zudums.

Permeabilizētās šūnās mitohondriji paliek lielā mērā saglabātā šūnas arhitektūrā, bet eksogēni substrāti un ADP var izkļūt cauri atvērtajai plazmatiskajai membrānai. Tas ir piemērots rīks, lai šūnas kontekstā identificētu defektu konkrētā substrāta izmantošanas ceļā. Pārmērīga permeabilizācija bojā ārējo membrānu, un citosoliskā regulācija tiek izskalota.

Neskartas šūnas saglabā visu: plazmatiskās membrānas barjeru, citosoliskos reducētājus, endogēno substrātu transportu, mitohondriju tīklu un ATP pieprasījumu. Tās ir vistuvāk fizioloģijai un vistālāk no mehānisma izolēšanas, jo krāsvielas uzņemšana, reducēšana un sekvestrācija kopā nosaka faktisko mitohondriju ekspozīciju.

TEGDMA pētījumā apzināti izmantoja visus trīs līmeņus: izolētus smadzeņu mitohondrijus, lai pētītu oksidēšanās un potenciāla atjaunošanu ar krāsvielu, permeabilizētas zobu pulpas cilmes šūnas galvenokārt, lai lokalizētu traucējumu ar I kompleksu saistītajā substrātu oksidēšanā, un neskartas cilmes šūnas, lai noteiktu 2 uM krāsvielas fizioloģisko kopējo ietekmi uz nomāktu skābekļa patēriņu. Lasītājiem, kas salīdzina mitohondriju rādījumus dažādos preparātos, saistītais skaidrojums par to, kā metilēnzilais pārvieto elektronus elpošanas ķēdē, sniedz pamatinformāciju par pārneses ceļiem, bet ceļvedis par metilēnzilā elpošanas pētījumu interpretēšanu skaidro koncentrāciju un inhibitoru izmantošanas loģiku.

Kontroles, kas nepieciešamas redoksaktīvai krāsvielai

Redoksciklu dalībniekam vajadzīgs garāks kontroļu saraksts nekā parastam inhibitoram, jo pašas krāsvielas ķīmiskie procesi var atdarināt bioloģiskus procesus.

Respirometrijā izmantojiet kameru tikai ar buferšķīdumu dreifa noteikšanai, kameru ar buferšķīdumu un krāsvielu bez bioloģiska materiāla, krāsvielu kopā ar jebkuru analīzē esošo ekstracelulāro reducētāju un noslēgumā rotenonu kopā ar antimicīnu, lai noteiktu nemitohondriālo skābekļa patēriņu neskartās šūnās. Ņemiet vērā, ka reducēta krāsviela atkārtoti oksidējas, pārnesot elektronus uz skābekli un veidojot ūdeņraža peroksīdu. Tāpēc tukšais paraugs tikai ar krāsvielu, bet bez elektronu donora, nepietiekami novērtē skābekļa patēriņu bezšūnu sistēmā, kas rodas, tiklīdz pieejams NADH vai NADPH.

Ūdeņraža peroksīda noteikšanai dodiet priekšroku kalibrētam Amplex UltraRed kopā ar mārrutku peroksidāzi, nevis neselektīvām DCFDA krāsvielām, pārbaudiet rezultātus ar katalāzi un pārbaudiet atkarību no apgaismojuma, jo krāsviela ir fotosensibilizators. Smadzeņu mitohondriju pētījumā konstatēja, ka jau pie 100 nM krāsvielas peroksīda slodze pieauga vairāk nekā četrkārt, bet tā izvadīšana palēninājās; peroksīds veidojās tieši no reducētās krāsvielas bez superoksīda starpprodukta. Sīkāka informācija par zonžu izvēli un apgaismojuma kontrolēm sniegta saistītajā rakstā par reaktīvo skābekļa formu mērīšanu eksperimentos ar krāsvielām, bet plašāks jautājums par to, kad peroksīds darbojas kā signāls un kad kā slodze, aplūkots kopā ar šūnu redokslīdzsvaru un apgalvojumiem par antioksidantiem.

Lai pamatotu apgalvojumus par pārneses ceļiem, pārbaudiet abas III kompleksa inhibitoru saistīšanās vietas: antimicīnu A Qi vietā un miksotiazolu Qo vietā, kā arī IV kompleksa galapunktu ar cianīdu. Agrākā peļu smadzeņu pētījumā ziņoja par elpošanas atjaunošanu ar krāsvielu pēc bloķēšanas ar rotenonu, bet ne pēc bloķēšanas ar antimicīnu, savukārt vēlākā trīs sugu pētījumā konstatēja daļēju atjaunošanos ar abiem inhibitoriem un pierādījumus par tiešu citohroma c reducēšanu. Uzskatiet apiešanu par saderīgu ar jaunākajiem datiem, nevis par galīgi pierādītu, jo krāsvielas koncentrācija, inhibitora saistīšanās vieta, substrāta stāvoklis un krāsvielas sadalījums maina novēroto ceļu.

Analīžu izvēles matrica

Izmantojiet šo tabulu, lai izvēlētos mērījumu atbilstoši jautājumam, nevis otrādi.

Lai apgalvojums būtu minimāli pārliecinošs, ar vienādām krāsvielas koncentrācijām — 100 nM, 300 nM, 1 uM un 2 uM — jāmēra skābekļa plūsma noplūdes apstākļos, kā arī ADP, oligomicīna un atjūdzēja klātbūtnē, ATP sintēzes ātrums, membrānas potenciāls, vēlams ar divām zondēm, un kalibrēta peroksīda izdalīšanās ar katalāzes un bezšūnu kontrolēm. Ziņojiet par saistīto datu kopumu: skābekļa plūsmu kopā ar ATP sintēzes ātrumu, ATP un skābekļa attiecību, potenciālu un peroksīdu. Jebkurš no šiem skaitļiem atsevišķi ir mērījums, kura nozīme vēl jānoskaidro.