Metilēnzilā antimikrobiālās un pretsēnīšu iedarbības pētījumi: gaismā un tumsā

Divi lasītāji, ieraugot vārdus «metilēnzilā antimikrobiālā iedarbība», iztēlojas atšķirīgas lietas. Viens iedomājas zilu šķidrumu, kas saskarē saindē mikrobus. Otrs iedomājas procedūru, kurā krāsviela kopā ar sarkano gaismu tos iznīcina. Abos priekšstatos ir daļa patiesības. Neviens no tiem nav pilnīgs, un tieši to sajaukšana rada lielāko daļu kļūdaino apgalvojumu internetā.

Šis pārskats ir veltīts šai atšķirībai. Pietiekamā koncentrācijā metilēnzilajam piemīt mērena toksicitāte tumsā. Sarkanās gaismas ietekmē tas kļūst par fotosensibilizatoru: absorbē fotonu, nonāk reaģētspējīgā tripleta stāvoklī un izraisa oksidatīvas reakcijas, kas vienlaikus bojā daudzus mērķus. Šim ar gaismu aktivētajam darbības režīmam ir savs nosaukums — antimikrobiālā fotodinamiskā terapija — un savi nosacījumi. Koncentrācija vien to nenosaka. Rezultātu nosaka viļņa garums, gaismas deva, inkubācija, skābeklis un organisms.

Divi mikroorganismu iznīcināšanas principi

Vispirms aplūkosim iedarbību tumsā. Metilēnzilais ir pozitīvi lādēta fenotiazīnija krāsviela. Tas saistās ar mikroorganismu šūnu apvalkiem, dažādā mērā iekļūst šūnās un piedalās oksidēšanās–reducēšanās un saistīšanās reakcijās. Fotoni šajā procesā nepiedalās. Mikroorganismi iet bojā, taču tikai tādā koncentrācijā, kas dažādiem organismiem ievērojami atšķiras, un mehānisms nav vērsts pret vienu skaidri noteiktu mērķi.

Fotodinamiskais princips pievieno gaismu. Sarkanās gaismas fotoni aptuveni 630 līdz 680 nm diapazonā atbilst krāsvielas absorbcijas joslai, kuras monomēra maksimums ir ap 664 nm. Absorbcija pārved krāsvielu īslaicīgā singleta stāvoklī, pēc tam — ilgāk pastāvošā tripleta stāvoklī. Tālāk iespējamas divas reakciju grupas. I tipa reakcijās tripleta stāvoklī esošā molekula pārnes elektronu uz substrātu un ierosina radikāļu reakcijas, kurās piedalās superoksīds un hidroksilradikāļi. II tipa reakcijās tā pārnes enerģiju tieši uz skābekli pamatstāvoklī un veido singleta skābekli. Abi procesi var norisināties vienlaikus, un saukt šo krāsvielu tikai par singleta skābekļa ģeneratoru būtu pārāk vienkāršoti. Pārskats par fenotiazīnija fotosensibilizatoru struktūras un aktivitātes saistību to parāda tieši: radniecīgām krāsvielām fototoksicitāte pret baktērijām neatbilda tikai singleta skābekļa iznākumam, jo uzņemšana, lokalizācija un reducēšanās līdz neaktīvajai leikoformai bija tikpat nozīmīgas kā fotofizika. Fotoķīmija, kas nosaka viļņa garuma nozīmi, ir skaidrota saistītajā pārskatā par krāsvielu un sarkano gaismu.

Singleta skābeklis ir būtisks vienai noderīgai īpašībai. Tas vienlaikus reaģē ar daudzām biomolekulām, tādēļ iedarbība ir daudzfaktoru, nevis vērsta pret vienu enzīmu vai saistīšanās proteīnu. Fotodinamiskās antimikrobiālās ķīmijterapijas pamataprakstā tas tika minēts kā iemesls, kāpēc parastajiem rezistences profiliem ir maza nozīme: papildu penicilīnu saistošs proteīns vai mutējusi topoizomerāze nebloķē reaktīvā skābekļa uzliesmojumu. Šī loģika apstiprinājās pārbaudēs ar pret meticilīnu rezistentu Staphylococcus aureus un pret vankomicīnu rezistentiem enterokokiem, kā redzams tālāk esošajā tabulā. Tas nenozīmē, ka rezistence nav iespējama, tikai to, ka tā darbojas citādi. Izplūdes sūkņi un antioksidatīvās aizsardzības mehānismi joprojām var mainīt nepieciešamo devu, īpaši sēnītēm.

Organismu un pētījumu modeļu tabula

Šī tabula ir raksta galvenais materiāls. Katra vērtība attiecas uz konkrētu protokolu: tā pati krāsviela, bet cita gaismas deva vai inkubācija dod citu skaitli. Neuzskatiet MBC, MLC un MIC par savstarpēji aizstājamiem rādītājiem. MBC un MLC šeit nozīmē, ka pēc pārsēšanas nav izdzīvojušu mikroorganismu, savukārt MIC nozīmē augšanas kavēšanu. Gaismas nosacījumi norādīti katrā ierakstā.

Organisms un modelis	Rezultāts tumsā	Rezultāts gaismā	Nosacījumi
S. aureus NCTC 6571, planktoniska suspensija	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Pārskata tabula, baltā gaisma 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, planktoniska suspensija	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Sākotnējais 1997. gada protokols, 1.7 mW per cm2 1 stundu, aptuveni 6.3 J per cm2, inokulāts ap 10^6 CFU per mL, aprakstīts sākotnējā pētījumā par fenotiazīnija fotobaktericīdo iedarbību
MRSA EMRSA-15, planktonisks	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Pārskata tabula, aptuveni 12 J per cm2, četrkārtīga jutības palielināšanās
MRSA EMRSA-16, planktonisks	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Tas pats protokols kā iepriekš
E. coli NCTC 9001, planktonisks	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Tas pats protokols, pieckārtīga jutības palielināšanās
P. aeruginosa NCTC 10622, planktonisks	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Tas pats protokols, divdesmitkārtīga jutības palielināšanās
E. faecalis NCTC 775, planktonisks	MLC 100 uM	MLC 100 uM	1997. gada protokols ar 6.3 J per cm2, šim celmam un devai uzlabojuma nebija
Pret vankomicīnu rezistents E. faecium, planktonisks	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Pārskata tabula, ar sākotnējo krāsvielu uzlabojuma nebija, savukārt hidrofobāki metilētie atvasinājumi deva uzlabojumu, saskaņā ar pētījumu par pret vankomicīnu rezistentu enterokoku
Candida albicans, planktoniska	MIC virs 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 un 1.59 ug per mL pie attiecīgi 5, 10 un 15 J per cm2	30 minūšu priekšinkubācija tumsā, sarkana LED gaisma 600 līdz 650 nm diapazonā ar maksimumu pie 635 nm, saskaņā ar metilēnzilā pretsēnīšu fotodinamiskās iedarbības devas un atbildes reakcijas pētījumu
C. albicans YEM14 salīdzinājumā ar celmu, kam ir paaugstināta izplūdes sūkņu ekspresija, iznīcināšana pēc CFU	Nav piemērojams	Sākotnējam celmam aptuveni 5 log iznīcināšana, celmam ar paaugstinātu CDR1/CDR2 ekspresiju iznīcināšana gandrīz nenotika	100 uM krāsvielas, 30 minūšu inkubācija, 660 nm pie 60 J per cm2, saskaņā ar pētījumu par izplūdes sūkņu ietekmi uz metilēnzilā izraisītu fotoiznīcināšanu
Trichophyton rubrum hifas salīdzinājumā ar sporām	Nav piemērojams	Hifām MIC aptuveni 6.3 ug per mL, sporām aptuveni 2.0 ug per mL; pilnīgai CFU nomākšanai hifām bija vajadzīgi 5 ug per mL un 100 J per cm2, bet sporām — 1.25 ug per mL un 40 J per cm2	635 nm fotodinamiskais protokols, saskaņā ar pētījumu par dermatofītu jutību dažādās attīstības stadijās
Nobriedusi 33 sugu subgingivāla bioplēve, Calgary ierīce, 6. diena	MB vien samazināja kopējo skaitu par vairāk nekā 80 procentiem	MB kopā ar 660 nm LED samazināja metabolisko aktivitāti aptuveni par 55 procentiem, bez plašām kopienas struktūras pārmaiņām	0.01 procenta krāsviela (100 ug per mL), 660 nm ar aptuveni 330 mW per cm2 5 minūtes, anaeroba augšana, saskaņā ar in vitro pētījumu par vairāku sugu mutes dobuma bioplēvi

Izceļas trīs likumsakarības. Pirmkārt, grampozitīvie stafilokoki iet bojā pie zemas mikromolāras koncentrācijas, savukārt gramnegatīvajām nūjiņām tumsā vajadzīgs aptuveni simtreiz vairāk krāsvielas, jo gramnegatīvo baktēriju ārējā membrāna ierobežo tās iekļūšanu. Gaisma samazina šo atšķirību, bet nenovērš to. Otrkārt, metilēnzilā pretsēnīšu iedarbība ir reāla, taču atkarīga no nosacījumiem: metilēnzilā izraisītā Candida iznīcināšana strauji pastiprinās, palielinoties gaismas devai, un viena fenotipa pārmaiņa, piemēram, paaugstināta izplūdes sūkņu ekspresija, pie tās pašas devas var pilnībā novērst 5 log iznīcināšanu. Treškārt, nobriedusi bioplēve uzvedas citādi nekā suspensijas, un tieši šajā kontekstā jāvērtē tabulas ieraksts par mutes dobuma bioplēvi.

Baktērijas: kur gaisma palīdz visvairāk un kur nepalīdz

Stafilokoki ir jutīgais piemērs. Pat pārskata tabulā norādītās vērtības epidēmiskajiem MRSA celmiem pēc apgaismošanas ir vienādas ar salīdzinājumam izmantotā vankomicīna vērtībām vai zemākas, un dimetilētie atvasinājumi darbojās vēl labāk, jo metilēšana palielināja lipofilitāti un singleta skābekļa iznākumu, vienlaikus kavējot reducēšanos līdz leikoformai. Šī ķīmiskā detaļa ir svarīga: tā parāda, ka iznīcināšana ir piegādes un fotofizikas kopīgs rezultāts, nevis tikai fotofizikas rezultāts.

Gramnegatīvie organismi ilustrē piegādes nozīmi. Pseudomonas tumsā vajadzēja 500 uM, bet gaismā — 25 uM, kas ir divdesmitkārtīgs uzlabojums, tomēr arī gaismā iegūtā vērtība ir ievērojami augstāka nekā stafilokokiem. Katjonu lādiņš palīdz krāsvielai pietuvoties ārējai membrānai, taču iekļūšana joprojām ir ierobežojošais faktors. Preparāta sastāvs, inkubācijas laiks un atvasinājuma izvēle maina šos skaitļus vairāk nekā tās pašas krāsvielas atkārtota lietošana lielākā devā.

Enterokoki liek ievērot piesardzību. Vecākajos protokolos E. faecalis gaisma nedeva nekādu priekšrocību, bet pret vankomicīnu rezistentam E. faecium bija vajadzīga cita molekula, nevis vairāk gaismas. Ikviens, kurš vienu metilēnzilā MBC vērtību min kā vispārēju antibakteriālu konstanti, nepareizi interpretē literatūru. Šādas konstantes nav. Ir tikai konkrētam celmam, barotnei, inokulātam, inkubācijai, viļņa garumam un starojuma enerģijas blīvumam atbilstošas vērtības. Tas, kā lasīt šīs vērtības, nemaldinot sevi, ir aplūkots mikroorganismu iznīcināšanas līkņu interpretācijas rokasgrāmatā.

Sēnītes: jutīgas, taču izšķiroša ir stadija un sūkņi

Sēnīšu šūnapvalki, kas sastāv no glikāniem, mannāniem un hitīna, rada atšķirīgu uzņemšanas problēmu nekā baktērijām, turklāt sēnītēm ir arī aktīvi aizsardzības mehānismi. Iepriekš minētais Candida izplūdes sūkņu rezultāts ir spilgtākais piemērs: tā pati krāsviela, tā pati gaisma, tā pati barotne, tomēr celms ar paaugstinātu ekspresiju izdzīvoja, bet sākotnējais celms zaudēja aptuveni 99.999 procentus kolonijas veidojošo vienību. Dermatofītiem nozīme ir arī attīstības stadijai. Sporas iet bojā daudz vieglāk nekā hifas, tādēļ protokols, kas iznīcina sporas, pie tās pašas devas var atstāt dzīvotspējīgus hifu fragmentus.

Tāpēc ziņojumos par metilēnzilā pretsēnīšu iedarbību vajadzīga tikpat rūpīga gaismas nosacījumu ievērošana kā pētījumos ar baktērijām. Klīniskajos fotodinamiskajos nagu un ādas pētījumos 1 līdz 2 procentu krāsvielu izmantoja kopā ar izmērītu sarkano gaismu pie noteikta starojuma enerģijas blīvuma un ar turpmāku novērošanu, turklāt klīnisko izskatu vērtēja atsevišķi no mikoloģiski apstiprinātas sēnīšu izzušanas. Šie pētījumi ir apskatīti nagu un ādas sēnīšu fotodinamisko pierādījumu kopsavilkumā. Atšķaidītas krāsvielas uzklāšana bojātajai vietai telpas apgaismojumā atkārto krāsu, bet ne pašu procedūru.

Pārbaude bioplēvē: 33 sugu mutes dobuma modelis

2024. gada pētījums par vairāku sugu mutes dobuma bioplēvi ir uzmanības vērts, jo tajā pārbaudīts sarežģītais, nevis vienkāršais gadījums. Trīsdesmit trīs mutes dobuma sugas, tostarp Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium un mutes dobuma streptokoki, anaerobos apstākļos līdz 6. dienai izveidoja nobriedušu bioplēvi. Apstrādei izmantoja 0.01 procenta krāsvielu un 660 nm LED gaismu 5 minūtes ar lielu apstarojuma intensitāti. Gan krāsviela atsevišķi, gan gaisma atsevišķi būtiski samazināja kopējo mikroorganismu skaitu, un abu kombinācija samazināja metabolisko aktivitāti aptuveni uz pusi, tomēr kopienas struktūra nemainījās un bioplēve netika sterilizēta.

Tā ir reāla iedarbība ar skaidri atzītām robežām. Tā pamato fotodinamiskas apstrādes izmantošanu kā lokālu papildmetodi iztīrītā periodonta kabatā, nevis kā skalošanas līdzekli, kas pats par sevi ārstē diagnosticētu periodontītu. Tas mūs noved pie vispārējās plaisas starp laboratoriju un ārstēšanu.

Kāpēc iznīcināšana laboratorijā nav tas pats, kas ārstēšana

Nosakot planktonisku mikroorganismu MBC, vienveidīgas šūnas pakļauj vienmērīgai krāsvielas un gaismas iedarbībai ar skābekli apgādātā barotnē. Bojājuma vietā neviena no šīm īpašībām nav nodrošināta. Matrikss palēnina iekļūšanu, persisteriem līdzīgi stāvokļi panes oksidāciju, asinis un eksudāts absorbē gaismu, audu ģeometrija rada ēnas, un hipoksiskas kabatas vājina II tipa reakcijas, jo singleta skābekļa veidošanai pēc definīcijas vajadzīgs molekulārais skābeklis. Jauktās infekcijās ir sugas ar atšķirīgu uzņemšanu un jutību, tāpēc viena references celma vērtība nevar raksturot visu skarto vietu.

Mutes dobuma piemērs šo plaisu padara konkrētu. Porphyromonas vai streptokoku skaita samazināšana laboratorijas platē vai kultivētas bioplēves nomākšana uz pusi nepierāda, ka zils skalošanas līdzeklis ārstē periodontītu, izārstē endodontisku infekciju vai novērš bakteriēmiju. Klīniskā periodonta aprūpe balstās uz bioplēves mehānisku izjaukšanu un noņemšanu, kā arī kabatas anatomisko apstākļu pārvaldību, savukārt uz gaismu balstīta apstrāde tiek pētīta kā lokāla papildmetode. Krāsvielas koncentrācijai, kas iznīcina baktērijas laboratorijas plates iedobē, nav nemainīgas saistības ar koncentrāciju, kas sasniedz baktērijas zem smaganu malas, un telpas apgaismojums nav 660 nm gaismas deva. Devas, drošības un mijiedarbību robežas jebkādai lietošanai mutes dobumā jāvērtē ārstam, kā izklāstīts drošības un mijiedarbību uzziņu materiālā.

Ko šie pierādījumi nenozīmē

Tie nav pamats apgalvojumam par sadzīves dezinfekcijas līdzekli. Baktericīdās iedarbības tabulās izmantoti noteikti celmi, barotnes, kontakta laiki, spektri un starojuma enerģijas blīvumi. Tās neko nepasaka par virtuves virsmām, vajadzīgo kontakta laiku organisku netīrumu klātbūtnē vai normatīvajiem dezinfekcijas standartiem.

Tie nenozīmē arī sistēmisku antibiotiku aizstājēju. Parastai fotodinamiskai iedarbībai vajadzīga krāsviela, absorbēta gaisma un skābeklis vienā vietā un vienā laikā. Gaisma nesasniedz dziļi esošus vai izkliedētus perēkļus tā, kā norītas zāles nonāk asinīs. Literatūrā šī pieeja paredzēta pieejamai lokālai infekcijai vai kā papildmetode — tieši tā, kā Veinraits jau sākotnēji raksturoja lokālu dezinfekciju.

Pamatots kopsavilkums ir šaurāks, taču joprojām interesants. Metilēnzilajam piemīt mērena antimikrobiāla aktivitāte tumsā, un sarkanā gaisma daudziem baktēriju un sēnīšu veidiem ļauj iegūt daudz spēcīgāku fotodinamisku iedarbību. To parāda lielās atšķirības starp gaismu un tumsu, piemēram, no 500 līdz 25 uM Pseudomonas gadījumā un no 80 līdz 20 uM epidēmiskā MRSA gadījumā, kā arī pamācošie neveiksmīgie rezultāti ar enterokokiem un Candida ar funkcionējošiem izplūdes sūkņiem. Rezultātu pārnesi uz praktisku lietojumu nosaka piegāde, bioplēves fizioloģija un skābeklis tikpat lielā mērā kā nominālā krāsvielas koncentrācija. Ja šie nosacījumi ir skaidri norādīti, skaitļiem ir nozīme. Ja tos atmet, skaitļi neko nenozīmē.