Lēflera sārmainā un polihromā metilēnzilā krāsojumu skaidrojums

Uz krāsošanas darba galda līdzās var stāvēt trīs pudeles, un uz katras etiķetes norādīts kāds metilēnzilā variants. Uz vienas rakstīts: metilēnzilā ūdens šķīdums 1%. Uz otras: Lēflera sārmainais metilēnzilais. Uz trešās: polihromais metilēnzilais. Aizņemts darbinieks paņem tuvāko pudeli. Uztriepe pēc tam iekrāsojas pārāk blāvi, pārāk vienmērīgi zila vai negaidītos violetos toņos, un rezultātā tiek vainots paraugs.

Tā ir šķīduma sastāva, nevis parauga problēma. Šie trīs šķīdumi satur radniecīgas krāsvielas, taču to pamatā ir atšķirīgi krāsošanas principi. Viens ir vienkārša katjonu krāsviela ar gandrīz neitrālu pH. Otrs ir tā pati krāsviela, kuras iedarbība pastiprināta ar sārmu. Trešais vairs nav viena krāsviela, bet gan apzināti oksidēts maisījums. Izvēloties nepareizo šķīdumu, jūs maināt pašu krāsošanas principu.

Īsā atbilde

Parastais metilēnzilā ūdens šķīdums ir atskaites punkts: aptuveni 1% krāsvielas ūdenī, vienkārša katjonu krāsviela baktēriju morfoloģijas izpētei un vispārējai mikroskopijai. Lēflera sārmainā metilēnzilā gadījumā ūdenī atšķaidītam spirta izejšķīdumam pievieno nelielu, precīzi nomērītu daudzumu atšķaidīta sārma, kas paaugstina pH un pastiprina katjonu krāsvielas saistīšanos ar baktēriju skābajām struktūrām. Polihromais metilēnzilais ir metilēnzilais, kas apzināti nogatavināts, oksidējot sārmainā vidē, tāpēc pudelē līdzās atlikušajam metilēnzilajam ir demetilētu homologu (azure A, azure B, azure C), tionīna un metilēnvioletā maisījums, kas dažādas struktūras iekrāso dažādos toņos.

Ja jāatceras tikai viens teikums: sārmināšana maina krāsojuma intensitāti, savukārt polihromēšana maina krāsojuma krāsas.

Parastais metilēnzilā ūdens šķīdums: atskaites punkts

Vienkāršākais sastāvs ir ūdenī izšķīdināts metilēnzilais, parasti 1% w/v koncentrācijā, bez sārma un bez oksidācijas. Krāsainā daļiņa ir metiltionīnija katjons ar hlorīda pretjonu — neliela, plakana fenotiazīna krāsviela, kas PubChem ierakstā par metilēnzilo aprakstīta kā metiltionīnija hlorīds. Kā katjons tā saistās ar nukleīnskābju fosfātu mugurkaulu un skābajām grupām baktēriju šūnu sieniņās, iekrāsojot šūnas zilas uz gaiša fona.

Šī šķīduma priekšrocība ir paredzamība. Kodoli un baktērijas izskatās zili. Kontrasts ir mērens. Vāji saskatāmi mikroorganismi var iekrāsoties vāji, un tieši šo ierobežojumu Lēflers centās novērst. Plašāku informāciju par vienkāršajām baktēriju krāsošanas metodēm, kurām pieder šis šķīdums, skatiet pārskatā par baktēriju vienkāršo krāsošanu. Arī šeit ir svarīgi precīzi pārbaudīt vielas identitāti: metilzilais ir pavisam cita molekula, kā paskaidrots rakstā metilzilais un metilēnzilais, tāpēc meklēšana katalogā tikai pēc krāsas nosaukuma var novest pie nepareizas krāsvielu klases izvēles.

Lēflera sārmainais metilēnzilais: tā pati krāsviela ar pastiprinātu iedarbību

Klasiskajā Lēflera receptē metilēnzilā spirta izejšķīdumu apvieno ar atšķaidītu sārma ūdens šķīdumu. Mācību grāmatās norādītajos variantos izmanto 0.3 g krāsvielas 30 mL 95% etanola un 100 mL 0.01% kālija hidroksīda ūdens šķīduma (vai līdzvērtīgi — 30 mL piesātināta metilēnzilā spirta šķīduma, 100 mL destilēta ūdens un 1 mL 1% KOH), iegūstot darba šķīdumu ar aptuveni 0.3% krāsvielas un izteikti sārmainu pH. Komerciālie varianti balstās uz to pašu principu, un Thermo Fisher mikrobioloģisko krāsvielu katalogā Lēflera sārmainais metilēnzilais līdzās polihromajam variantam un ūdens šķīdumam ir norādīts kā atsevišķa kataloga pozīcija ar atšķirīgu paredzēto pielietojumu.

Galvenā nozīme ir sārmam. Paaugstinot pH, parauga karboksilgrupas un fosfātgrupas deprotonējas, palielinot negatīvi lādēto saistīšanās vietu blīvumu, savukārt spirta izejšķīdums uztur krāsvielu pilnībā izšķīdušu, lai tā šīs vietas sasniegtu monomēru formā. Rezultāts ir ātrāka un intensīvāka baktēriju iekrāsošanās nekā ar neitrālu krāsvielas ūdens šķīdumu, veidojot ierastos tumši zilos nūjiņu un koku attēlus ikdienas bakterioloģiskajā uztriepē. Krāsošana parasti ilgst vienu līdz trīs minūtes, pēc tam preparātu noskalo ar ūdeni.

Klasiskais pielietojums ir uz Lēflera seruma barotnes audzētas Corynebacterium diphtheriae: slaidas, bieži vālesveida nūjiņas ar intensīvi iekrāsotām metahromatiskām Babesa–Ernsta granulām, kurās uzkrāts polifosfāts. Barotnes un krāsvielas kombinācija ir vēsturiska — abas saistītas ar vienu un to pašu bakteriologu, un granulu kontrasts nodrošina diagnostisko ieguvumu. Papildus difterijas izmeklējumiem šo šķīdumu izmanto kā vispārēju bakterioloģisko krāsvielu kultūru uztriepēm, Neisseria morfoloģijas izpētei klīniskajās uztriepēs un visur, kur Grama krāsojums nav nepieciešams, bet parastais metilēnzilā ūdens šķīdums dod pārāk blāvu rezultātu. Tas ir monohroms krāsojums. Visas skābās struktūras iegūst kādu zilu nokrāsu. Ja protokols paredz diferenciāciju pēc krāsas, ar sārmu vien to panākt nevar.

Viens praktisks brīdinājums: sārmainie krāsvielu šķīdumi uzglabāšanas un oglekļa dioksīda uzņemšanas laikā degradējas un veido nogulsnes. Laboratorijas vai nu sagatavo nelielus daudzumus, vai iegādājas katalogā pieejamo šķīdumu un ievēro tā derīguma termiņu, nevis turpina izmantot vecu pudeli, no kuras uz katra priekšmetstikliņa nonāk nogulsnes.

Polihromais metilēnzilais: viens nosaukums, vairākas krāsvielas

Polihromā metilēnzilā iegūšanai izmanto to pašu sākotnējo krāsvielu, taču pakļauj to kontrolētai oksidācijai sārmainā vidē; vēsturiski šo procesu sauca par nogatavināšanu vai polihromēšanu. Novecināšana sārmainā vidē, karsēšana ar karbonātu vai oksidēšana ar tādiem līdzekļiem kā dihromāts pakāpeniski atšķeļ metilgrupas no dimetilamino aizvietotājiem. Produkts ir maisījums: atlikušais metilēnzilais kopā ar azure B (atšķelta viena metilgrupa), azure A un azure C (tālāka demetilēšana), tionīnu (pilnībā demetilēts) un metilēnvioletā saimes oksidācijas blakusproduktiem. Katram komponentam ir sava nokrāsa un afinitāte pret audiem, tāpēc maisījums krāso metahromatiski: kodoli, granulas, mucīni un skrimšļi katrs iegūst atšķirīgus toņus no zila līdz sarkanvioletam.

Šī pati ķīmija ir slaveno asins preparātu krāsojumu pamatā. Agrīnie pētnieki atklāja, ka sārmināts metilēnzilais iekrāso malārijas parazītu kodolus violetos toņos, taču viņu nogatavinātie ūdens šķīdumi bija nestabili un dažu dienu laikā veidoja nogulsnes. Pārskatā par to, kā tika izgudrots violetais asins preparātu krāsojums, izsekots tam, kā Malahovskis un Romanovskis 1891. gadā neatkarīgi viens no otra izmantoja šo efektu, kā tika ieviests metanols, lai stabilizētu krāsvielas nogulsnes un fiksētu uztriepes bez karsēšanas, un kā vēlāk Gīmza standartizēja maisījumu, izmantojot nomērītu azure B daudzumu kopā ar eozīnu un stabilizējot to ar glicerīnu. Mūsdienu Gīmzas tipa krāsvielas ir tieši atvasinātas no polihromā metilēnzilā un eozīna kombinācijas, kas rada Romanovska efektu. Plašāk par kombināciju ar eozīnu un azure B komponentu skatiet rakstā Romanovska tipa krāsvielas un azure B mijiedarbība ar eozīnu.

Tā kā polihromais metilēnzilais ir maisījums, pēc būtības tas ir vismazāk standartizētais no šiem trim variantiem. Precīzs nokrāsu līdzsvars ir atkarīgs no oksidācijas metodes un pakāpes, tāpēc histoloģijas materiālu piegādātāji to pārdod kā atsevišķu produktu ar savām veiktspējas pārbaudēm, nevis kā novecinātu Lēflera šķīdumu. Tipiski pielietojumi ietver tuklo šūnu granulu, mucīnu un skrimšļu metahromatisku vizualizāciju, plazmas šūnu detaļu izcelšanu un Helicobacter pylori noteikšanu audu griezumos ar Gudpāsčera tipa polihromajām metodēm. Tā ir pareizā izvēle, ja nepieciešama diferenciācija pēc krāsas, un nepareizā izvēle, ja protokols paredz skaidru, monohromu baktēriju siluetu.

Sastāva un pielietojuma salīdzinājums

Izmantojiet tabulu kā izvēles algoritmu. Ja paraugs iekrāsojas pārāk blāvi, mainiet pieeju pH un izvēlieties Lēflera šķīdumu. Ja viss iekrāsojas, bet nekas nav savstarpēji atšķirams, mainiet krāsvielas principu un izvēlieties polihromo variantu. Ja ar Lēflera šķīdumu krāsotā uztriepē granulas redzamas lieliski, bet vadītājs jautā, kāpēc kodoli un citoplazma ir vienādi zili, atbilde ir tāda, ka neviens sārmains monohroms krāsojums nevar nodrošināt šādu diferenciāciju. Šis uzdevums pieder polihromajai saimei un tās atvasinājumiem asins preparātu krāsošanai.

Kā izvairīties no ierastās sajaukšanas

Lielāko daļu neskaidrību rada divas kļūdas. Pirmā ir uzskatīt Lēflera šķīdumu par savstarpēji aizvietojamu ar parasto metilēnzilo, jo abi pudelē izskatās zili. Tie atšķiras pēc pH un krāsojuma intensitātes, un, aizstājot Lēflera šķīdumu ar neitrālu krāsvielu protokolā, kas paredz Lēflera šķīdumu, zūd tieši tas granulu kontrasts, kura iegūšanai protokols izstrādāts. Otrā kļūda ir uzskatīt jebkuru vecu vai nejauši novecinātu sārmaino metilēnzilo par polihromu. Nekontrolēta novecināšana rada nezināmu maisījumu ar nezināmu krāsošanas spēju, savukārt īstos polihromos šķīdumus gatavo ar noteiktām oksidācijas metodēm un asins preparātu krāsojumu saimē apvieno ar nomērītu eozīna daudzumu. Vēsture šeit ir pamācoša: 1890. gadu nestabilos nogatavinātos ūdens šķīdumus aizstāja stabilizēti metanola šķīdumi tieši tāpēc, ka nekontrolētu maisījumu rezultātus nebija iespējams reproducēt. Šo mācību vērts atcerēties, pirms diagnostiska preparāta krāsošanai izmantot pudeli, kuras vecums nav zināms.

Precīza nosaukumu pārbaude palīdz novērst šīs kļūdas. Pārbaudiet uz etiķetes kataloga produktu (ūdens šķīdums, Lēflera vai polihromais), krāsvielas saturu un paredzēto pielietojumu, nevis spriediet pēc krāsas. Šiem trim sastāviem ir kopīga hromofora izcelsme. To pielietojums nav kopīgs.