Jaunais metilēnzilais un retikulocītu krāsošana: atsevišķa krāsviela un dzīvu šūnu metode

Students gatavojas retikulocītu skaitīšanai, pasūta metilēnzilo, sajauc to ar asinīm un gandrīz neko neredz. Kursabiedrs izmanto pudeli ar marķējumu «jaunais metilēnzilais» un daļā eritrocītu iegūst skaidri saskatāmus zilus pavedienus. Pirmais students pieņem, ka otrajā pudelē esošā krāsviela ir svaigāka vai koncentrētāka. Tā nav ne viena, ne otra. Tajā ir cita molekula.

Šī kļūdainā izpratne ir pamatā lielākajai daļai neskaidrību šajā jomā. Nosaukums liek domāt, ka jaunais metilēnzilais ir uzlabota metilēnzilā partija. Ķīmija liecina par ko citu. Jaunais metilēnzilais N ir atsevišķa fenotiazīna krāsviela ar savu Colour Index numuru, savu aizvietotāju izvietojumu un savu standartizētu lietojumu hematoloģijā. Kad šī atšķirība ir skaidra, pārējais par metodi — kāpēc krāsošanas laikā šūnām jābūt dzīvām, ko uzskata par retikulocītu, kāda ir Hainca ķermenīšu nozīme un kad izmanto briljantkrezilzilo — kļūst saprotams.

Īsā atbilde

Hematoloģijas reaģentu jauno metilēnzilo N parasti identificē kā Basic Blue 24 PubChem ierakstā par jauno metilēnzilo, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formula C18H22ClN3S. Parastais metilēnzilais ir metiltionīnija hlorīds, Basic Blue 9, tā PubChem ierakstā, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formula C16H18ClN3S. Jaunā metilēnzilā struktūrā ir divas metilgrupas pie gredzena un etilamino sānu ķēdes, savukārt metilēnzilajam ir dimetilamino grupas. Šī atšķirība maina krāsošanas īpašības. Hematoloģijas literatūrā parastais metilēnzilais aprakstīts kā samērā vāja retikulocītu krāsviela, bet jaunais metilēnzilais — kā tāds, kas nodrošina intensīvāku un vienmērīgāku krāsojumu; šis salīdzinājums apkopots ScienceDirect tematiskajā sadaļā par jauno metilēnzilo.

Jā, jaunais metilēnzilais ir supravitāla krāsviela. Supravitāla krāsošana nozīmē dzīvu šūnu krāsošanu pēc to izņemšanas no organisma un pirms fiksācijas, kā definēts NCBI pārskatā par supravitālās krāsošanas principiem. Šajā kategorijā ietilpst gan jaunais metilēnzilais, gan briljantkrezilzilais, un CLSI retikulocītu standarts nepārprotami ietver jauno metilēnzilo kā supravitālu krāsvielu. Studenti dažkārt šo metodi pieskaita fiksētu uztriepju krāsošanai pēc Romanovska. Šāda izpratne šeit neder. Ja vispirms veic fiksāciju, metode vairs nedarbojas.

Lasītājiem, kuri cenšas orientēties līdzīgos krāsvielu nosaukumos, raksts metilzilais un metilēnzilais aplūko citu, plašāku neskaidrību — atšķirību starp anjonisku triarilmetāna krāsvielu un katjonisko fenotiazīnu saimi. Laboratorijas krāsošanas metožu pārskatā supravitālā krāsošana aplūkota līdzās fiksētu uztriepju metodēm, savukārt asins šūnu morfoloģijas ceļvedis parāda retikulocītu novērtēšanas vietu plašākā diferenciālās vērtēšanas kontekstā.

Viena piesardzības piezīme par katalogiem: pastāv arī atsevišķa jaunā metilēnzilā cinka hlorīda dubultsāls forma ar CAS 6586-05-6. Tāpēc metožu sadaļā jānorāda sāls forma un piegādātājs, nevis tikai vispārpieņemtais nosaukums.

Ko supravitālā krāsošana patiesībā dara

Retikulocīts ir jauns eritrocīts, kas zaudējis kodolu, bet saglabājis ribosomālās RNS atliekas. Nekrāsotā mitrā preparātā šī RNS nav redzama. Supravitālā krāsviela iekļūst dzīvajā šūnā un izgulsnē vai sakopo šo RNS zilās granulās un pavedienos — retikulofilamentozajā materiālā, kas redzams, izmantojot eļļas imersiju. Tātad tīklojums ir krāsošanas rezultāts, nevis iepriekš izveidots karkass, kas tikai gaida iekrāsošanu. Tāpēc protokola mainīgie lielumi — krāsvielas koncentrācija, buferis, asiņu un krāsvielas attiecība, temperatūra un laiks — ir tikpat svarīgi kā krāsvielas nosaukums.

Praktiski tas nozīmē stingru darbību secību: vispirms sajauc ar antikoagulantu apstrādātas asinis ar krāsvielu, inkubē, tad sagatavo uztriepes un izmeklē tās nefiksētas un bez papildu krāsošanas. Fiksācija pirms krāsošanas vai papildu krāsošana, kas aizsedz vāji saskatāmus pavedienus, iznīcina informāciju, uz kuru balstās skaitīšana.

Praktisks retikulocītu krāsošanas protokols ar jauno metilēnzilo

Nav viena universāla sastāva, tāpēc jānorāda izmantotais. Trīs dokumentēti varianti parāda iespējamo diapazonu.

Klasiskajā Brehera tipa procedūrā izmanto aptuveni 0.5 procentu jauno metilēnzilo ar kālija oksalātu, ko vienādos tilpumos sajauc ar rūpīgi samaisītām EDTA asinīm un inkubē apmēram 10 līdz 15 minūtes istabas temperatūrā. Pēc saudzīgas atkārtotas samaisīšanas sagatavo plānas ķīļveida uztriepes, izžāvē gaisā un izmeklē nefiksētas ar 100x eļļas imersijas objektīvu. NCBI retikulocītu skaitīšanas procedūrā aprakstīta šī darbību secība un tajā izmantotais skaitīšanas rāmis.

Dacie un Lewis variantā izmanto 1.0 procenta jauno metilēnzilo citrāta sāls šķīdumā, sajauc ar 2 līdz 4 asiņu tilpumiem un pirms uztriepju sagatavošanas tur 37 C temperatūrā 15 līdz 20 minūtes. Nesenā CLSI H44 procedūras harmonizācijas īstenojumā izmantoja atšķaidītāku, 0.1 procenta šķīdumu ar fosfātiem buferētā fizioloģiskajā šķīdumā pie pH 7.4, inkubējot 20 C temperatūrā 10 minūtes un neveicot fiksāciju, kā ziņots 2026. gada NMB harmonizācijas pētījumā.

Skaitīšanas noteikumi visiem variantiem ir kopīgi. Šūnu uzskaita kā retikulocītu, ja tajā ir vismaz divas atsevišķas zili iekrāsotas granulas vai pavedienu segmenti; tādējādi tiek izslēgtas atsevišķas krāsvielas nogulsnes. Ikdienas darbā saskaita vismaz 1,000 eritrocītu un retikulocītu daudzumu norāda procentos. Ja to īpatsvars ir zems, statistiski nepieciešams lielāks šūnu skaits. CLSI H44 metodoloģijas pārskatā norādīts, ka pie aptuveni 1 procenta retikulocītu nepieciešamas apmēram 4,400 šūnas, lai skaitīšanas variāciju samazinātu līdz 5 procentiem; tas aprakstīts CLSI H44 pārskatā De Gruyter vietnē. Millera okulāra disks ļauj praktiski veikt liela šūnu skaita skaitīšanu. Krāsvielu filtrē vai sagatavo svaigu, jo nogulsnes atgādina granulārus ieslēgumus.

Hainca ķermenīši tajā pašā preparātā

Tajā pašā supravitāli krāsotajā uztriepē var redzēt arī Hainca ķermenīšus, kas ir oksidēta un denaturēta hemoglobīna sakopojumi, nevis RNS atliekas. Preparātos ar jauno metilēnzilo tie izskatās kā apaļi ķermenīši, bieži pa vienam un membrānas tuvumā, un iekrāsojas gaišāk zilā krāsā nekā retikulofilamentozais materiāls. Fiksācijas un papildu krāsošanas laikā tie slikti saglabājas, tāpēc jāizmeklē nefiksēta uztriepe. Nesenā protokolā, kurā izmantoja 20 mikrolitrus EDTA asiņu ar 20 mikrolitriem 1 procenta jaunā metilēnzilā un 15 minūšu inkubāciju, Hainca ķermenīšus saturošās šūnas uzskaitīja starp 250 eritrocītiem; tas aprakstīts PMC pētījumā, kurā ziņots par šo procedūru.

Divas atšķirības palīdz izvairīties no kļūdainas interpretācijas. Pirmkārt, metilvioletais un kristālvioletais iekrāso Hainca ķermenīšus intensīvāk nekā jaunais metilēnzilais, kā norādīts ScienceDirect tematiskajā sadaļā par Hainca ķermenīšiem. Jaunais metilēnzilais ir ērta izvēle, ja retikulocītus un Hainca ķermenīšus novērtē kopā, taču tā nav visintensīvākā tieši Hainca ķermenīšiem paredzētā krāsviela. Otrkārt, alfa talasēmijas pazīmes gadījumā HbH ieslēgumi pēc supravitālās krāsošanas veido daudzus sīkus punktus visā šūnā, savukārt klasiskie Hainca ķermenīši ir retāki, lielāki un bieži saistīti ar membrānu. Trešais līdzīgais veidojums ir krāsvielas nogulsnes: tās atrodas ārpus šūnu fokusa plaknes un dažādos redzes laukos atšķiras.

Briljantkrezilzilais salīdzinājumā ar jauno metilēnzilo

Abas krāsvielas izmanto retikulocītu supravitālai krāsošanai, taču standartizācijā priekšroka dota vienai no tām. CLSI H44-A2 retikulocītu metode, kas izstrādāta kopīgi ar Starptautisko hematoloģijas standartizācijas padomi un norādīta CLSI H44 standarta lapā, nosaka EDTA asiņu krāsošanu ar jauno metilēnzilo kā manuālo salīdzināšanas metodi. Klasiskā hematoloģijas mācību literatūra ir vienisprātis par izskatu: jaunais metilēnzilais nodrošina intensīvāku un vienmērīgāku pavedienu krāsojumu, savukārt briljantkrezilzilā krāsojums vairāk atšķiras starp partijām un paraugiem.

Šim statusam nepieciešama atruna. ICSH analizatoru novērtēšanas vadlīnijās manuālā mikroskopija ar jauno metilēnzilo ir pieņemta kā references salīdzināšanas pieeja, taču tā raksturota kā subjektīva un samērā neprecīza; ja pieejamas, priekšroka dodama plūsmas citometrijas references procedūrām. 2022. gada salīdzinājumā ar 100 paraugiem briljantkrezilzilajam konstatēja mazāku sistemātisko novirzi no izmantotā analizatora nekā jaunajam metilēnzilajam, kā ziņots PMC krāsošanas metožu salīdzinājumā. Studentiem pamatots kopsavilkums būtu šāds: izmantojiet jauno metilēnzilo kā standartizēto manuālo salīdzināšanas metodi, pārbaudiet jebkuru vietējo briljantkrezilzilā metodi pret to vai pret automatizētu metodi un abos gadījumos rēķinieties ar lielāku manuālās mikroskopijas rezultātu izkliedi. Arī agrākā standartizācijas literatūrā attīrīts Azure B tika ieteikts kā ķīmiski tīrāka alternatīva, jo komerciālās krāsvielu partijas atšķīrās; tas aprakstīts Māršala pētījumā par Azure B un izskaidro, kāpēc diskusijās par metodēm joprojām tiek pieminēta reaģenta tīrības pakāpe.

Kā izvairīties no tipiskajām kļūdām

Lielāko daļu neveiksmīgo preparātu izskaidro četras kļūdas. Ja jaunā metilēnzilā N vietā pasūta parasto metilēnzilo, vāju krāsojumu izraisa ķīmiskās īpašības, nevis tehnika. Fiksācija vai papildu krāsošana pirms novērtēšanas novērš supravitālās krāsošanas signālu. Krāsvielas nogulšņu uzskaitīšana kā granulām paaugstina rezultātu; to novērš divu granulu noteikums un filtrēta krāsviela. Ja pie zema retikulocītu īpatsvara saskaita pārāk maz šūnu, iegūst šķietami precīzu skaitli ar plašām ticamības robežām. Visām šīm kļūdām ir viena kopīga pazīme: mikroskopijas veicējs vaino mikroskopu par rezultātu, ko noteicis reaģenta izmantošanas posms.