Метилен көгінің жұтылу спектрі және молярлық жұтылу коэффициенті: өлшеу шарттары көрсетілген анықтамалық

Метилен көгінің спектрі ондағы бір санды басқа өлшеуге қолдануға тырысқанға дейін қарапайым болып көрінеді. Бір зертхана молярлық экстинкция коэффициентін шамамен 82,000 деп береді. Екіншісі 67,000 деп көрсетеді. Үшіншісі 100,000-нан жоғары мән келтіреді. Үшеуі де өз өлшеулерін дұрыс сипаттауы мүмкін, бірақ олардың ешқайсысы бояғыштың әмбебап тұрақтысы емес.

Түсінбеушілік екі бөлек ұғымды араластырудан туындайды. Оптикалық тығыздық — белгілі бір кюветадағы нақты ерітінді үшін өлшенетін шама. Ал көбіне эпсилон деп белгіленетін молярлық жұтылу коэффициенті — сол ерітіндінің моделіндегі параметр. Метилен көгінің ассоциация күйі өзгергенде, модель де, оның параметрі де өзгереді. Сондықтан әр коэффициентті өлшеу шарттары тіркелген мән ретінде қарастырған жөн: санмен бірге толқын ұзындығы, еріткіш, pH немесе буфер, температура, концентрация аралығы және оптикалық жол ұзындығы берілуі керек.

Сұйылтылған сулы ерітіндідегі мономер жолағы

Сұйылтылған сулы ерітіндіде метилен көгі катионының басым жолағы шамамен 664 пен 665 nm аралығында орналасады; аспап пен калибрлеу тәсіліне қарай әдебиетте әдетте 664 пен 668 nm аралығындағы мәндер келтіріледі. Ерітінді бояғыштың басым бөлігі мономер күйінде болатындай жеткілікті сұйылтылған болса, сандық анықтау үшін осы жолақты таңдаған дұрыс.

Әдебиеттегі үш мән өлшеу шарттарының негізгі саннан маңыздырақ екенін көрсетеді. Сазды зерттеген ғалымдар сулы үлгілердің концентрациясын шамамен 7 micromolar-дан төмен ұстап, 1 cm кюветаларды қолданғанда, 665 nm-де эпсилонның шамамен 82,000 M-1 cm-1 мәнін алған. Бұл мән өте сұйылтылған сулы үлгілер үшін эмпирикалық калибрлеу түзуінің көлбеулігі ретінде ерекше жақсы құжатталған. Кейінірек 2.34 пен 37.52 micromolar аралығын және 1 cm оптикалық жолды қолданған деиондалған судағы бастапқы калибрлеу зерттеуі бояғыштың жалпы мөлшері үшін 665 nm-де шамамен 67,100 M-1 cm-1 мәнін берген. Бұл төмен нәтиже қайшылық емес, күтілетін құбылыс: калибрлеу аралығының жоғарғы жартысында димердің елеулі мөлшері бар. Үшінші мән, 664 nm-де шамамен 73,460 M-1 cm-1, pH 6.86 және 293 K жағдайында өлшенген спектрді мономерлік және димерлік бөліктерге жіктеген зерттеуден алынған; ол метилен көгінің фотофизикасына арналған жуырдағы сыни шолуда қорытындыланған. Бұл сан — оптикалық тығыздықтың бояғыштың жалпы мөлшеріне тәуелділігінің тікелей көлбеулігі емес, деконволюция арқылы бөлінген мономерлік компонент.

Практикалық түйін: шарттары үлгілеріңізге сәйкес келетін коэффициентті таңдаңыз немесе өз калибрлеуіңізді жасаңыз. 82,000 мәнін концентрациясы 30 micromolar фосфат буферіндегі талдауға көшіріп қолданып, сызықтық тәуелділік әлі де сақталады деп ойламаңыз.

Қысқа толқынды иықша — бірнеше үлестің қосындысы

Концентрация артқанда, шамамен 600 бен 615 nm аралығындағы иықша 664 nm шыңына қатысты ұлғаяды. Қазіргі зерттеулер H-типті димердің үлесін әдетте 605 пен 610 nm аралығына жатқызады. Судағы метилен көгінің спектрлерін кешенді талдау димер максимумын 607 nm-де, жоғары ретті агрегат максимумын 600 nm-де, ал мономердің резонанстық компоненттерін 664 және 650 nm-де ажыратады. Оның толық мәтіні PMID 33251415 бойынша ашық қолжетімді жазбада берілген.

Бұл иықшаны тек димердің жұтылуы деп белгілеуге болмайды. Сол аймаққа мономердің виброндық құрылымы да үлес қосады, сондықтан өлшенген биіктік бірнеше үлестің қабаттасуынан пайда болады. Бір кешенді сәйкестендіруде мономер мен димерден тұратын модель 1.1 micromolar-дан 3.4 millimolar-ға дейінгі толық аралықты сипаттай алмаған, ал тетрамерді қосу ең жақсы сәйкестік берген; тетрамер сигналы 34 micromolar-дан төмен концентрацияларда да анықталған. Модель бойынша сәйкестендірілген компоненттердің жұтылу коэффициенттері жоғары болған: негізгі мономерлік компонент үшін 664 nm-де шамамен 107,800 M-1 cm-1, димер үшін 607 nm-де шамамен 101,400, ал тетрамер үшін 600 nm-де шамамен 138,500. Бұл өлшеулер буферсіз деиондалған суда, натрий хлоридінің концентрациясы 0 мен 0.15 M аралығында және температура 282 мен 333 K аралығында жүргізілген. Бұлар модель арқылы ажыратылған бөліктер болғандықтан, оларды Бер–Ламберт тәуелділігінің эмпирикалық көлбеулігінің орнына қолдануға болмайды.

Димерленудің қарқындылығы тікелей сандық анықталған. pH 6.86 және 293 K жағдайында бір зерттеу димерлену тұрақтысының шамамен 3,900 M-1 мәнін алған. Бұл шама концентрациясы 5 micromolar жұмыс ерітіндісінің неліктен дерлік сызықтық тәуелділік көрсететінін, ал концентрациясы 50 micromolar бастапқы ерітіндінің неліктен олай емес екенін түсіндіреді. Әдісті әзірлеу кезінде шамамен 610 nm-дегі оптикалық тығыздықтың шамамен 665 nm-дегі оптикалық тығыздыққа қатынасын тексеру пайдалы. Бұл қатынас концентрациямен бірге өскенде, 664 nm-дегі эпсилон енді құрамы өзгермейтін бір түрді сипаттамайды.

Бір-біріне айналатын екі түр басым болатын концентрация аралығында спектрлер ортақ изосбестикалық нүкте арқылы өтуі мүмкін; сулы ерітінділер қатарында ол тәжірибе жүзінде шамамен 625 nm-де байқалады. Айқын, орны өзгермейтін нүкте екі түрдің басым болуымен үйлеседі. Концентрация артқанда бұл нүкте ығысса немесе жоғалса, оны аспап қатесі емес, жоғары ретті агрегаттар немесе өзгерген тепе-теңдіктер пайда болғанының ескертуі ретінде қабылдаңыз.

Еріткіш, pH және температура спектрді өзгертеді

Су ассоциацияға қолайлы жағдай жасайды. Метилен көгінің су мен DMSO қоспаларындағы еріткіш әсерін зерттеуіне сәйкес, диметилсульфоксид қосу димерленуді тежейді, жұтылу мен флуоресценция максимумдарын ұзын толқындар жағына ығыстырады және флуоресценцияның кванттық шығымын шамамен төрт есе арттырады; бұл жұмыс PMID 30933781 ретінде индекстелген. Зерттеу сулы ерітінді спектрлерін мономер–димер тепе-теңдігі тұрғысынан қарастырады: мономердің жұтылуы шамамен 650 мен 670 nm аралығында, ал димердің жұтылуы шамамен 580 мен 615 nm аралығында орналасады. Димерлену тұрақтылары 293.15 K жағдайындағы спектрлерден есептелген.

Спирттер жолақтың орнын да, көрінерлік жұтылу күшін де өзгертеді, бірақ агрегаттануды жоймайды. Метилен көгіне еріткіштің әсерін зерттеген жұмыста берілген, концентрациясы 31.3 micromolar және бөлме температурасындағы бір бастапқы салыстыруда ұзын толқынды максимум суда 665 nm, ал метанолда 655 nm болған. Бүкіл ерітінді үшін көрінерлік коэффициент мәндері суда шамамен 37,100, ал метанолда 60,800 болған. Абсолютті этанолда 298 K жағдайында жүргізілген бөлек тексеруде максимум 655 nm-де, ал эпсилон шамамен 68,000 болған.

Кәдімгі pH өзгерістері спектрді көптеген хаттамаларда болжанғаннан азырақ ығыстырады. Жоғарыда келтірілген сыни шолу шамамен pH 2-ден pH 12-ге дейін максимум 665 nm маңында сақталғанын, ал pH 11-ге дейін жұтылу күші аз ғана өзгергенін хабарлайды. Буфердің түрі мен иондық күш нәтижеге номинал pH шамасындай әсер етуі мүмкін, сондықтан тек pH-метр көрсеткішін емес, нақты буфер мен тұзды да тіркеңіз. Күшті қышқыл немесе күшті сілті жағдайын бөлек қарастыру керек, өйткені бояғыш қайтымды ассоциацияның орнына химиялық өзгеріске ұшырауы мүмкін. Температура мен тұз да тепе-теңдікті ығыстырады, сондықтан 2020 жылғы судағы зерттеуде екеуі де әдейі өзгертілген.

Өлшенген санның жарамдылығын сақтау

Сандық өлшеулер Бер–Ламберт қатынасына сүйенеді: оптикалық тығыздық эпсилон, концентрация және оптикалық жол ұзындығының көбейтіндісіне тең. Сонымен бірге сызықтық аралықтың нақты өлшеу шарттарыңызда сақталатынын дәлелдеу қажет.

Төмен микромолярлық концентрациялармен жұмыс істегенде 1 cm кюветаны пайдаланыңыз. Эпсилон шамамен 82,000 болса, 5 micromolar концентрацияда оптикалық тығыздық шамамен 0.41, ал 10 micromolar концентрацияда шамамен 0.82 болады. Қоспасыз судағы мономерге бағытталған өлшеу үшін концентрацияны шамамен 5 пен 7 micromolar маңында немесе одан төмен ұстау ондаған micromolar аймағына дейін калибрлеуден қауіпсізірек. Концентрлі бастапқы ерітінділер үшін оптикалық тығыздықтың 1-ден әлдеқайда жоғары болуына жол бермей, оптикалық жолды қысқартыңыз.

Бос үлгі үшін дәл сондай матрицаны қолданыңыз: судың тазалық дәрежесі, қосымша еріткіштің үлесі, буфер мен тұздар бірдей болсын, тек бояғыш болмасын. Калибрлеу ерітінділерін сол матрицада және сол температурада дайындаңыз. Әдісті әзірлегенде бір ғана толқын ұзындығын өлшеудің орнына бүкіл көрінетін диапазонды, дұрысы шамамен 550 мен 750 nm аралығын сканерлеңіз. Тек биіктікті емес, пішінді де қадағалаңыз. Егер бірізді сұйылту нормаланған спектр пішінін өзгертсе, жүйенің химиялық күйі концентрацияға тәуелді. Максимумның және 610 мен 665 nm-дегі оптикалық тығыздықтар қатынасының тұрақтылығы жарамды аралықты тек R квадратының жоғары мәніне қарағанда сенімдірек дәлелдейді.

Реагенттің формасын құжаттаңыз. Коммерциялық өнім сусыз метилтиониний хлориді немесе тригидрат сияқты гидрат болуы мүмкін, сондықтан бастапқы ерітіндіні есептеуге қолданылатын молярлық масса құтыдағы нақты затқа сәйкес келуі керек. Осы қадамның өзі әр зертханадағы номинал молярлық концентрациялар арасындағы айырмашылықтың бір бөлігін түсіндіреді. Осындай ұқыптылық нәтижелер сандық талдау есептеулеріне енгізілгенде, спектрлер құрамның тұрақтылығын тексеруге пайдаланылғанда және қоспалар профилі тазалық пен спецификацияны бағалауды қажет еткенде де маңызды.

Өлшеу шарттары көрсетілген қорытынды

Бұл кестені өзара алмастырылатын тұрақтылар көзі емес, зертханалық жазбаның бастапқы үлгісі ретінде пайдаланыңыз.

Демек, метилен көгінің жұтылу толқын ұзындығы туралы қысқа жауапқа ұзақ түсіндірме қажет. Өзіңіз өлшеген шыңды, өлшеген ерітіндіде және өлшеген концентрацияда көрсетіңіз. Осы әдет сұйылтылған сулы ерітіндіге тән 664 nm маңындағы бір мәннің жалған әмбебап тұрақтыға айналуына жол бермейді.