მეთილენის ლურჯის შთანთქმის სპექტრი და მოლური შთანთქმის კოეფიციენტი: ცნობარი პირობების მითითებით

მეთილენის ლურჯის სპექტრი მარტივი ჩანს, სანამ მისგან აღებული რიცხვის ხელახლა გამოყენებას არ შეეცდებით. ერთი ლაბორატორია მოლური ექსტინქციის კოეფიციენტისთვის დაახლოებით 82,000-ს მიუთითებს. მეორე — 67,000-ს. მესამე — 100,000-ზე მეტს. სამივე შეიძლება სწორად აღწერდეს შესაბამის გაზომვებს, მაგრამ არცერთი არ არის ამ საღებავის უნივერსალური მუდმივა.

დაბნეულობას ორი განსხვავებული ცნების აღრევა იწვევს. აბსორბანსი არის კონკრეტული ხსნარის კონკრეტულ კიუვეტაში გაზომილი სიდიდე. მოლური შთანთქმის კოეფიციენტი, რომელსაც ხშირად ეფსილონით აღნიშნავენ, ამ ხსნარის მოდელის პარამეტრია. როდესაც მეთილენის ლურჯის ასოციაციის მდგომარეობა იცვლება, მოდელიც იცვლება და, შესაბამისად, პარამეტრიც. სასარგებლო მიდგომაა, თითოეული კოეფიციენტი პირობებით განსაზღვრულ მნიშვნელობად განიხილოთ: რიცხვს თან უნდა ახლდეს ტალღის სიგრძე, გამხსნელი, pH ან ბუფერი, ტემპერატურა, კონცენტრაციის დიაპაზონი და ოპტიკური გზის სიგრძე.

მონომერის ზოლი განზავებულ წყალხსნარში

განზავებულ წყალხსნარში მეთილენის ლურჯის კათიონის დომინანტური ზოლი დაახლოებით 664-დან 665 nm-მდე მდებარეობს; სხვადასხვა ხელსაწყოსა და კალიბრაციის მიდგომის მიხედვით, ჩვეულებრივ, 664-დან 668 nm-მდე დიაპაზონს ასახელებენ. ეს ზოლი რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის შესაფერისია, როდესაც ხსნარი იმდენად განზავებულია, რომ საღებავის უმეტესი ნაწილი მონომერულია.

ლიტერატურაში მოცემული სამი მნიშვნელობა აჩვენებს, რატომ არის პირობები უფრო მნიშვნელოვანი, ვიდრე ცალკე აღებული რიცხვი. თიხის მკვლევრებმა, რომლებიც წყალხსნარის ნიმუშების კონცენტრაციას დაახლოებით 7 მიკრომოლარზე დაბლა ინარჩუნებდნენ და 1 cm-იან კიუვეტებს იყენებდნენ, 665 nm-ზე ეფსილონის მნიშვნელობად დაახლოებით 82,000 M-1 cm-1 მიუთითეს. ეს მნიშვნელობა განსაკუთრებით კარგად არის დოკუმენტირებული, როგორც ძალიან განზავებული წყალხსნარის ნიმუშებისთვის მიღებული ემპირიული საკალიბრაციო მრუდის დახრილობა. მოგვიანებით ჩატარებულმა პირველადმა კალიბრაციამ დეიონიზებულ წყალში, 2.34-დან 37.52 მიკრომოლარამდე კონცენტრაციებისა და 1 cm ოპტიკური გზის გამოყენებით, საღებავის ჯამური რაოდენობისთვის 665 nm-ზე დაახლოებით 67,100 M-1 cm-1 აჩვენა. ეს უფრო დაბალი შედეგი მოსალოდნელია და არა წინააღმდეგობრივი, რადგან საკალიბრაციო დიაპაზონის ზედა ნახევარი უკვე დიმერის საგრძნობ რაოდენობას შეიცავს. მესამე მნიშვნელობა, დაახლოებით 73,460 M-1 cm-1 664 nm-ზე, მიღებულია pH 6.86-სა და 293 K-ზე ჩატარებულ კვლევაში, სადაც დაკვირვებული სპექტრი მონომერისა და დიმერის კომპონენტებად დაშალეს; ეს შეჯამებულია მეთილენის ლურჯის ფოტოფიზიკის ბოლოდროინდელ კრიტიკულ მიმოხილვაში. ეს რიცხვი დეკონვოლუციით გამოყოფილ მონომერულ კომპონენტს ეხება და არა აბსორბანსის საღებავის ჯამურ კონცენტრაციაზე დამოკიდებულების უშუალო დახრილობას.

პრაქტიკული დასკვნა ასეთია: აირჩიეთ კოეფიციენტი, რომლის პირობებიც თქვენს ნიმუშებს შეესაბამება, ან თავად ჩაატარეთ კალიბრაცია. 30 მიკრომოლარული ფოსფატური ბუფერის ანალიზში 82,000-ს ნუ გამოიყენებთ იმ ვარაუდით, რომ წრფივობა კვლავ შენარჩუნებულია.

მოკლეტალღოვანი მხარი ნარევის შედეგია

კონცენტრაციის ზრდასთან ერთად, დაახლოებით 600-დან 615 nm-მდე მდებარე მხარი 664 nm-ის პიკთან შედარებით იზრდება. თანამედროვე კვლევები H ტიპის დიმერის წვლილს, ჩვეულებრივ, დაახლოებით 605-დან 610 nm-მდე ათავსებს. წყალში მეთილენის ლურჯის გლობალური სპექტრული ანალიზი გამოყოფს დიმერის მაქსიმუმს 607 nm-ზე და უფრო მაღალი რიგის აგრეგატის მაქსიმუმს 600 nm-ზე, ხოლო მონომერის რეზონანსულ კომპონენტებს — 664 და 650 nm-ზე. სრული ტექსტი ხელმისაწვდომია PMID 33251415-ის ღია წვდომის ჩანაწერში.

ეს მხარი მხოლოდ დიმერის აბსორბანსად არ უნდა ჩაითვალოს. იმავე უბანში წვლილი მონომერის ვიბრონულ სტრუქტურასაც შეაქვს, ამიტომ გაზომილი სიმაღლე მათი სუპერპოზიციაა. ერთმა გლობალურმა მორგებამ აჩვენა, რომ მონომერისა და დიმერის მოდელი ვერ აღწერდა მთელ დიაპაზონს 1.1 მიკრომოლარიდან 3.4 მილიმოლარამდე, ხოლო ტეტრამერის დამატებამ საუკეთესო მორგება უზრუნველყო; ტეტრამერის სიგნალი უკვე 34 მიკრომოლარზე დაბალ კონცენტრაციებშიც გამოვლინდა. მორგებით მიღებული კომპონენტების კოეფიციენტები მაღალი იყო: მთავარი მონომერული კომპონენტისთვის დაახლოებით 107,800 M-1 cm-1 664 nm-ზე, დიმერისთვის დაახლოებით 101,400 607 nm-ზე და ტეტრამერისთვის დაახლოებით 138,500 600 nm-ზე, უბუფერო დეიონიზებულ წყალში, ნატრიუმის ქლორიდის 0-დან 0.15 M-მდე კონცენტრაციითა და 282-დან 333 K-მდე ტემპერატურებით. ეს მოდელით გამოყოფილი კომპონენტებია, ამიტომ მათი გამოყენება ბერ–ლამბერტის ემპირიული დახრილობის ნაცვლად დაუშვებელია.

დიმერიზაციის ინტენსივობა უშუალოდაც არის რაოდენობრივად განსაზღვრული. pH 6.86-სა და 293 K-ზე ერთმა კვლევამ დიმერიზაციის მუდმივისთვის დაახლოებით 3,900 M-1 მიიღო. ეს სიდიდე ხსნის, რატომ იქცევა 5 მიკრომოლარული სამუშაო ხსნარი თითქმის წრფივად, ხოლო 50 მიკრომოლარული საწყისი ხსნარი — არა. მეთოდის შემუშავებისას სასარგებლოა დაახლოებით 610 nm-ზე აბსორბანსის შეფარდების შემოწმება დაახლოებით 665 nm-ზე აბსორბანსთან. როდესაც ეს შეფარდება კონცენტრაციასთან ერთად იზრდება, 664 nm-ზე ეფსილონი უკვე აღარ აღწერს ერთ უცვლელ ქიმიურ ფორმას.

კონცენტრაციის ისეთ ინტერვალში, სადაც ერთმანეთში გარდამავალი ერთი წყვილი დომინირებს, სპექტრებს შეიძლება საერთო იზოსბესტური წერტილი ჰქონდეთ; წყალხსნარების სერიებში ის ექსპერიმენტულად დაახლოებით 625 nm-ზე აღინიშნება. მკაფიო, უძრავი წერტილი ორი დომინანტური ქიმიური ფორმის არსებობას შეესაბამება. თუ კონცენტრაციის ზრდასთან ერთად წერტილი გადაადგილდება ან ქრება, ეს აღიქვით უფრო მაღალი რიგის აგრეგატების გაჩენის ან წონასწორობების ცვლილების ნიშნად და არა ხელსაწყოს შეცდომად.

გამხსნელი, pH და ტემპერატურა სპექტრს ცვლის

წყალი ასოციაციას უწყობს ხელს. დიმეთილსულფოქსიდის დამატება თრგუნავს დიმერიზაციას, შთანთქმისა და ფლუორესცენციის მაქსიმუმებს უფრო გრძელი ტალღებისკენ გადააქვს და ფლუორესცენციის კვანტურ გამოსავლიანობას დაახლოებით ოთხჯერ ზრდის, როგორც აღწერილია წყლისა და DMSO-ს ნარევებში მეთილენის ლურჯზე გამხსნელის გავლენის კვლევაში, რომელიც ინდექსირებულია როგორც PMID 30933781. ეს ნაშრომი წყალხსნარის სპექტრებს მონომერ–დიმერის წონასწორობად განიხილავს, მონომერის შთანთქმით დაახლოებით 650-დან 670 nm-მდე და დიმერის შთანთქმით დაახლოებით 580-დან 615 nm-მდე, და 293.15 K-ზე სპექტრებიდან დიმერიზაციის მუდმივებს გამოითვლის.

სპირტები ცვლის როგორც მაქსიმუმის მდებარეობას, ისე მოჩვენებით ინტენსივობას, მაგრამ აგრეგაციას არ აუქმებს. 31.3 მიკრომოლარზე და ოთახის ტემპერატურაზე ჩატარებულ ერთ პირველად შედარებაში, რომელიც აღწერილია მეთილენის ლურჯზე გამხსნელის გავლენის კვლევაში, გრძელტალღოვანი მაქსიმუმი წყალში 665 nm-ზე იყო, ხოლო მეთანოლში — 655 nm-ზე; მთლიანი ხსნარისთვის მოჩვენებითი მნიშვნელობები წყალში დაახლოებით 37,100-ს, ხოლო მეთანოლში 60,800-ს შეადგენდა. აბსოლუტურ ეთანოლში 298 K-ზე ჩატარებულმა ცალკე ვალიდაციამ მაქსიმუმი 655 nm-ზე აჩვენა, ეფსილონის დაახლოებით 68,000 მნიშვნელობით.

pH-ის ჩვეულებრივი ცვლილებები სპექტრს უფრო ნაკლებად გადაადგილებს, ვიდრე ბევრ პროტოკოლში ვარაუდობენ. ზემოთ ციტირებული კრიტიკული მიმოხილვის თანახმად, დაახლოებით pH 2-დან pH 12-მდე მაქსიმუმი 665 nm-ის მახლობლად რჩებოდა, ხოლო pH 11-მდე ინტენსივობა მხოლოდ მცირედ იცვლებოდა. ბუფერის სახეობამ და იონურმა ძალამ შეიძლება შედეგებზე ისეთივე გავლენა მოახდინოს, როგორც ნომინალურმა pH-მა, ამიტომ ჩაიწერეთ რეალურად გამოყენებული ბუფერი და მარილი და არა მხოლოდ pH-მეტრის ჩვენება. ძლიერი მჟავა ან ძლიერი ტუტე ცალკე შემთხვევაა, რადგან საღებავში შექცევადი ასოციაციის ნაცვლად შეიძლება ქიმიური ცვლილება მოხდეს. ტემპერატურა და მარილიც გადაანაცვლებს წონასწორობას, ამიტომ 2020 წლის წყლის კვლევაში ორივე პარამეტრს მიზანმიმართულად ცვლიდნენ.

როგორ გავზომოთ ისე, რომ რიცხვმა ვალიდურობა შეინარჩუნოს

რაოდენობრივი მუშაობა ეფუძნება ბერ–ლამბერტის დამოკიდებულებას: აბსორბანსი უდრის ეფსილონის, კონცენტრაციისა და ოპტიკური გზის სიგრძის ნამრავლს. ამასთან, საჭიროა დადასტურება, რომ თქვენს პირობებში წრფივი ინტერვალი ნამდვილად შენარჩუნებულია.

დაბალ მიკრომოლარულ კონცენტრაციებზე სამუშაოდ გამოიყენეთ 1 cm-იანი კიუვეტა. როდესაც ეფსილონი დაახლოებით 82,000-ია, 5 მიკრომოლარზე აბსორბანსი დაახლოებით 0.41-ს შეადგენს, ხოლო 10 მიკრომოლარზე — დაახლოებით 0.82-ს. უბრალო წყალში მონომერზე ორიენტირებული გაზომვისთვის დაახლოებით 5-დან 7 მიკრომოლარამდე ან უფრო დაბალ კონცენტრაციაზე დარჩენა უფრო უსაფრთხოა, ვიდრე კალიბრაციის ათეულობით მიკრომოლარის დიაპაზონში ღრმად გაგრძელება. კონცენტრირებული საწყისი ხსნარებისთვის შეამცირეთ ოპტიკური გზის სიგრძე, ნაცვლად იმისა, რომ 1-ზე ბევრად მაღალი აბსორბანსი მისაღებად ჩათვალოთ.

ბლანკისთვის გამოიყენეთ იდენტური მატრიცა: იმავე ხარისხის წყალი, თანაგამხსნელის იგივე წილი, იგივე ბუფერი და მარილები, ოღონდ საღებავის გარეშე. საკალიბრაციო ხსნარები იმავე მატრიცაში და იმავე ტემპერატურაზე მოამზადეთ. მეთოდის შემუშავებისას დაასკანირეთ მთელი ხილული დიაპაზონი, სასურველია დაახლოებით 550-დან 750 nm-მდე, და არა მხოლოდ ერთი ტალღის სიგრძე. აკონტროლეთ ფორმაც და არა მხოლოდ სიმაღლე. თუ მიმდევრობითი განზავება ნორმალიზებულ ფორმას ცვლის, სისტემის ქიმიური მდგომარეობა კონცენტრაციაზეა დამოკიდებული. სტაბილური მაქსიმუმი და 610-სა და 665 nm-ზე აბსორბანსების სტაბილური შეფარდება მისაღები დიაპაზონის უფრო ძლიერი მტკიცებულებაა, ვიდრე მხოლოდ მაღალი R-კვადრატი.

დააფიქსირეთ რეაგენტის ფორმა. კომერციული მასალა შეიძლება იყოს უწყლო მეთილთიონინიუმის ქლორიდი ან ჰიდრატი, მაგალითად ტრიჰიდრატი, ამიტომ საწყისი ხსნარის გამოთვლებისთვის გამოყენებული მოლური მასა რეალურად გამოყენებული ბოთლის შიგთავსს უნდა შეესაბამებოდეს. მხოლოდ ეს ნაბიჯიც კი ხსნის ლაბორატორიებს შორის ნომინალური მოლური კონცენტრაციების განსხვავების ნაწილს. ასეთივე სიზუსტეა საჭირო, როდესაც შედეგები რაოდენობრივი ანალიზის გამოთვლებში გამოიყენება, სპექტრები ფორმულაციის სტაბილურობის შემოწმებას ემსახურება, ან მინარევების პროფილები სისუფთავისა და სპეციფიკაციების გადახედვას მოითხოვს.

შეჯამება პირობების მითითებით

ეს ცხრილი გამოიყენეთ ლაბორატორიული ჩანაწერის საწყის შაბლონად და არა ურთიერთჩანაცვლებადი მუდმივების წყაროდ.

ამრიგად, მეთილენის ლურჯის შთანთქმის ტალღის სიგრძეს მოკლე პასუხი აქვს, რომელსაც ვრცელი შენიშვნა სჭირდება. მიუთითეთ თქვენ მიერ გაზომილი პიკი, იმ ხსნარში და იმ კონცენტრაციაზე, რომლებზეც გაზომვა ჩაატარეთ. ეს ჩვევა განზავებული წყალხსნარისთვის მიღებულ ერთ მნიშვნელობას, დაახლოებით 664 nm-ზე, მცდარ უნივერსალურ მუდმივად ქცევისგან იცავს.