მეთილენის ლურჯი და Bartonella: ლაბორატორიული შედეგები და კლინიკური მტკიცებულებების შეზღუდვები

კულტურის ჭურჭელსა და პაციენტს ერთი სიტყვა აერთიანებს — ინფექცია, თუმცა ამ სიტყვის უკან განსხვავებული ცნებები დგას. ჭურჭელში ინფექცია აგარზე კოლონიების რაოდენობაა. პაციენტში კი ეს არის უჯრედებსა და სისხლძარღვებში არსებული ბაქტერიები, სისხლსა და ქსოვილებში მოძრავი პრეპარატები და იმუნური სისტემა, რომელიც სამუშაოს ნაწილს ასრულებს. თუ ამ ორს ერთმანეთში ავურევთ, შთამბეჭდავი ლაბორატორიული რიცხვი მკურნალობას დაემსგავსება. თუ ერთმანეთისგან გავმიჯნავთ, იგივე რიცხვი დარჩება იმად, რაც სინამდვილეშია: მომდევნო ექსპერიმენტის ჩატარების საფუძვლად.

მეთილენის ლურჯისა და Bartonella-ს ამ მიმოხილვის მთავარი ამოცანა სწორედ ეს გამიჯვნაა. ერთი კვლევითი ჯგუფის ორმა ლაბორატორიულმა კვლევამ მეთილენის ლურჯი არამზარდ მდგომარეობაში მყოფი Bartonella henselae-ს წინააღმდეგ გამოსცადა. ორივემ მინისა და პლასტმასის ჭურჭელში ძლიერი აქტივობა აჩვენა. არცერთში ადამიანი არ გამოუკვლევიათ.

რატომ იკვლევენ მეცნიერები სტაციონარულ ფაზას

ანტიბიოტიკების ტესტირების უმეტესობაში მზარდ უჯრედებს იყენებენ. ეს მოდელი უფრო რთულ შემთხვევას ვერ მოიცავს: უჯრედებს, რომლებმაც გაყოფა შეწყვიტეს და იტანენ იმ პრეპარატებს, რომლებიც მათ მზარდ თანამოძმეებს კლავს.

Bartonella-ს ორგანიზმში ხანგრძლივად დარჩენა შეუძლია, მათ შორის ერითროციტებისა და ენდოთელური უჯრედების შიგნით. ამიტომ ჯგუფმა დასვა კითხვა: რომელ დამტკიცებულ პრეპარატებს შეუძლია B. henselae-ს მოკვლა მას შემდეგ, რაც ის სტაციონარულ ფაზაში გადავა? მზარდი უჯრედების მიმართ დაბალი MIC სტაციონარულ ფაზაში უჯრედების მოკვლას ვერ წინასწარმეტყველებდა. რიფამპინს ძალიან დაბალი MIC ჰქონდა, თუმცა სტაციონარულ უჯრედებს ცუდად კლავდა, მაშინ როცა უფრო მაღალი MIC-ის მქონე ნაერთები მათ ეფექტიანად კლავდა. მკითხველები, რომლებსაც ამ ტიპის ნაშრომის შეფასების ზოგადი მეთოდი სურთ, მას მეთილენის ლურჯის კვლევების წაკითხვის გზამკვლევში იპოვიან.

პირველი სკრინინგი: Li და კოლეგები, 2019

Antibiotics-ში გამოქვეყნებულმა სტაციონარული ფაზის 2019 წლის სკრინინგმა გამოიყენა ერთი შტამი, B. henselae JK53, რომელიც Schneider-ის საკვებ არეში იზრდებოდა ნაყოფის მსხვილფეხა რქოსანი პირუტყვის შრატის 10 percent შემცველობით, 37 C ტემპერატურაზე და 5 percent CO2-ის პირობებში. ერთდღიანი კულტურები ძირითადად განცალკევებული, გამყოფი უჯრედებისგან შედგებოდა. ხუთდღიანი კულტურები, რომელთა რაოდენობა დაახლოებით 10-ის მე-8 ხარისხი კოლონიის წარმომქმნელი ერთეული იყო თითო mL-ზე, სტაციონარულ ფაზად მიიჩნიეს; ისინი ხილულ აგრეგატებს შეიცავდა.

ტესტისთვის გამოიყენეს SYBR Green I პროპიდიუმის იოდიდთან ერთად; კალიბრაცია ცოცხალი და იზოპროპანოლით მოკლული უჯრედების ნარევებით ჩატარდა. ვინაიდან მეთილენის ლურჯს მკვეთრი შეფერილობა აქვს, აქტიური ნაერთების შედეგები ჯერ მიკროსკოპიით, შემდეგ კი სისხლიან აგარზე კოლონიების დათვლით გადაამოწმეს — ეს უფრო მკაცრი საბოლოო საზომია.

50 micromolar კონცენტრაციაზე გამოცდილი 1,581 დამტკიცებული პრეპარატიდან მეთილენის ლურჯის შემთხვევაში სიცოცხლისუნარიანობა ფირფიტის წამკითხველით 16 percent, ხოლო მიკროსკოპიით 25 percent იყო. დაპტომიცინის მაჩვენებელი იყო 21 percent, რამდენიმე აზოლის — 22-დან 27 percent-მდე, გენტამიცინის — 32 percent, ერითრომიცინის — 66 percent, ციპროფლოქსაცინის — 74 percent. პირევინიუმის პამოატი წამკითხველის მონაცემებით უფრო ძლიერი ჩანდა, თუმცა საკუთარი ფლუორესცენციის გამო მიკროსკოპიით მისი შეფასება შეუძლებელი იყო.

მზარდი B. henselae-ს მიმართ მეთილენის ლურჯის MIC იყო 0.08-დან 0.16 micrograms per mL-მდე. ხუთდღიან სტაციონარულ უჯრედებზე 5 micrograms per mL კონცენტრაციით მოქმედებისას, ერთი დღის შემდეგ კოლონიების რაოდენობა აღმოჩენის ზღვარს ქვემოთ დაეცა; შედეგი ემთხვეოდა დაპტომიცინისა და პირევინიუმის პამოატის შედეგებს მათი გამოცდილი კონცენტრაციების პირობებში. მოკვლის დროითი დინამიკის ცალკე ექსპერიმენტში გამოიყენეს 10 micrograms per mL. ეს ლაბორატორიული ექსპოზიციის დონეებია და არა დოზები; ნაშრომშიც ისინი სწორედ ასეა წარმოდგენილი. ადამიანში პლაზმის პიკური კონცენტრაციის ციტირებული მაჩვენებელი, დაახლოებით 3.9 micrograms per mL, ნაშრომში მხოლოდ ზოგად კონტექსტად არის მოცემული. მეთილენის ლურჯის ფარმაკოკინეტიკის მიმოხილვა განმარტავს, რატომ არ შეიძლება პლაზმის მაჩვენებლის ქსოვილის მაჩვენებლად მიჩნევა.

ნაშრომში ორი შეზღუდვა პირდაპირ არის აღნიშნული. არ გამოყენებულა ბიოფილმის მოდელი და არ ჩატარებულა მეთილენის ლურჯის კომბინაციების ტესტირება. ხუთდღიანი აგრეგატები სტაციონარულ თხევად კულტურაში არსებული გროვები იყო და არა ვალიდირებული ბიოფილმის ექსპერიმენტი. ავტორებმა საჭიროდ მიიჩნიეს ცხოველებზე კვლევები, კომბინაციების შესწავლა, ბიოფილმის კვლევები და Bartonella-ს სხვა სახეობებზე ტესტირება.

კომბინაციები და ბიოფილმიდან მიღებული უჯრედები: Zheng და კოლეგები, 2020

BMC Microbiology-ში გამოქვეყნებულმა 2020 წლის შემდგომმა კვლევამ იგივე შტამი და საკვები არე შეინარჩუნა, თუმცა ექვსდღიან სტაციონარულ კულტურებზე გადავიდა და დაამატა ორი რამ, რაც პირველ ნაშრომს აკლდა: ორი პრეპარატის კომბინაციები და ბიოფილმიდან მიღებული უჯრედების მოდელი.

ცალკეული პრეპარატების ერთნაირი, 5 micrograms per mL კონცენტრაციით 24 საათის განმავლობაში გამოცდისას, მეთილენის ლურჯის შემდეგ დარჩა 3.2 გამრავლებული 10-ის მე-4 ხარისხზე კოლონიის წარმომქმნელი ერთეული თითო mL-ზე, მაშინ როცა საკონტროლო მაჩვენებელი დაახლოებით 2.8 გამრავლებული 10-ის მე-10 ხარისხზე იყო. ციპროფლოქსაცინმა, გენტამიცინმა და ნიტროფურანტოინმა იმავე დროის წერტილში ნაკლები კოლონია დატოვა. ეს განსხვავდება 2019 წლის შედეგისგან, როდესაც იმავე ნომინალურმა კონცენტრაციამ ერთი დღის შემდეგ აღმოჩენადი კოლონიები აღარ დატოვა. კულტურის ასაკი, სიმჭიდროვე და დამუშავება განსხვავდებოდა, ამიტომ მოკვლის ეფექტი მიმართულებით განმეორდა, მაგრამ მასშტაბით იდენტური არ იყო. ექსპერიმენტებს შორის ეს განსხვავება ერთ-ერთი მიზეზია, რის გამოც უსაფრთხოებისა და ურთიერთქმედებების სტანდარტული შეფასება ლაბორატორიულ სიძლიერეს კლინიკური ეფექტისგან განცალკევებით განიხილავს.

კომბინაციების სკრინინგი ყველაზე ხშირად ციტირებული ნაწილია. თითოეული კომპონენტის კონცენტრაცია 5 micrograms per mL-ზე იყო ფიქსირებული. როგორც აზითრომიცინმა მეთილენის ლურჯთან, ისე რიფამპინმა მეთილენის ლურჯთან ერთად 24 საათში სტაციონარული ფაზის აღმოჩენადი კოლონიები აღარ დატოვა; იგივე შედეგი აჩვენა ციპროფლოქსაცინის ორივე წყვილმა. 25 გამოცდილი წყვილიდან ეს მხოლოდ ამ ოთხმა შეძლო. სინერგიის ფორმალური ანალიზი არ ჩატარებულა, ამიტომ სწორი ტერმინია ამ პირობებში აქტიური კომბინაცია და არა დამტკიცებული სინერგია.

ბიოფილმის ექსპერიმენტში გამოიცადა ახალგაზრდა, დაშლილი ბიოფილმიდან მიღებული უჯრედები და არა პრეპარატის შეღწევა დაუზიანებელ, მომწიფებულ ბიოფილმში. კულტურები ხუთი დღის განმავლობაში გაზარდეს, შემდეგ გააზავეს და ჭებიანი ფირფიტების ჭებში კიდევ ხუთი დღე მოათავსეს, კრისტალური იისფერით შეღებვის გზით დაადასტურეს ბიოფილმის არსებობა და პრეპარატებით დამუშავებამდე ზედაპირიდან ჩამოფხიკეს. მხოლოდ მეთილენის ლურჯის გამოყენებისას, 5 micrograms per mL კონცენტრაციაზე, მე-6 დღისთვის მაჩვენებელი 2.3 გამრავლებული 10-ის მე-2 ხარისხზე დაეცა; ეს ერთ-ერთი საუკეთესო შედეგი იყო ცალკეულ პრეპარატებს შორის, მაგრამ ნულს არ უდრიდა. მეთილენის ლურჯის ორივე კომბინაციამ მე-6 დღისთვის ნულს მიაღწია, ისევე როგორც ციპროფლოქსაცინის ორივე კომბინაციამ.

ავტორებმა აღნიშნეს იგივე შეზღუდვები, რომლებსაც ყურადღებიანი მკითხველიც შეამჩნევდა: ახალგაზრდა, ჩამოფხეკილი ბიოფილმი ძველი, დაუზიანებელი ბიოფილმის ნაცვლად; ყველა პრეპარატისთვის ერთი მოსახერხებელი კონცენტრაცია თითოეული პრეპარატის რეალისტური პიკური კონცენტრაციის ნაცვლად; მხოლოდ შერჩეული წყვილები აზითრომიცინის ან რიფამპინის მონაწილეობით; ერთი შტამი; არც ცხოველები და არც პაციენტები. სამი პრეპარატის შემდგომი კვლევა მხოლოდ შეთავაზებული იყო და მისი შედეგები არ წარმოდგენილა.

კვლევის დიზაინების შედარება

ეს ცხრილი სტატიის მთავარ აზრს მოკლედ გადმოსცემს. ბოლო სვეტის მარცხნივ ყველაფერი კულტურაზე ჩატარებული სამუშაოა. არცერთი ნაშრომის მონაცემები ბოლო სვეტს არ შეესაბამება.

Bartonella არ არის Borrelia

ორივე ნაშრომში ნახსენებია Borrelia burgdorferi, ლაიმის დაავადების გამომწვევი სპიროქეტა, რადგან საღებავზე დაფუძნებული ტესტი იმავე ლაბორატორიაში Borrelia-ს სტაციონარული ფაზის ადრინდელი კვლევებიდან მოდიოდა, სადაც მეთილენის ლურჯი და დაპტომიცინიც აქტიურ ნაერთებად გამოვლინდა. ეს ისტორია სასარგებლო კონტექსტია და შეცდომების ხშირი წყაროც.

Bartonella-ს შესახებ არცერთ ნაშრომში არ არის ექსპერიმენტი, რომელიც Borrelia-სა და Bartonella-ს პარალელურად გამოცდიდა. ორგანიზმები, საკვები არეები და კონცენტრაციები განსხვავდება; Bartonella-ში მეთილენის ლურჯის სავარაუდო მემბრანული ეფექტი კი წარმოდგენილი იყო როგორც ვარაუდი, რომელსაც დამატებითი შესწავლა სჭირდება. შედეგები ერთი სახეობიდან მეორეზე არ უნდა გადავიტანოთ და არცერთი ნაშრომი არ ამყარებს პარაზიტების შესახებ ფართო მტკიცებებს. სწორედ ამ მიზეზით, Borrelia-სა და Bartonella-ს პერსისტერი უჯრედების შედარება ამ ორ კვლევით ლიტერატურას ერთმანეთისგან მიჯნავს.

რატომ არ იქცევა კულტურის შედეგები პროტოკოლად

მეთილენის ლურჯით ბარტონელოზის მკურნალობის პროტოკოლის ძიების მიმართ ინტერესი გასაგებია. სწორედ ეს ნაშრომები აჩვენებს, რატომ უნდა აღვიქვათ ეს ფრაზა გამაფრთხილებელ ნიშნად და არა საყიდლების სიად.

პირველ რიგში, ჭაში 5 micrograms per mL კონცენტრაცია დანიშნულება არ არის. მასში არ არის გათვალისწინებული შეწოვა, განაწილება, ცილებთან შეკავშირება, უჯრედშიდა შეღწევა ან ამტანობა. ავტორებმა ეს კონცენტრაცია ანტიბიოტიკების პიკური მაჩვენებლების მიახლოებით საშუალოდ შეარჩიეს და აღნიშნეს, რომ მომავალ კვლევებში თითოეული პრეპარატი თავის რეალისტურ დონეზე უნდა გამოიცადოს.

მეორე, ნული კოლონია ნიშნავს, რომ დათესვის მოცემულ პირობებში კოლონიები არ აღმოჩნდა და არა იმას, რომ ქსოვილი სტერილურია. პერსისტერი უჯრედები, უჯრედშიდა ბაქტერიები და ნიმუშის აღების შეზღუდვები აგარის ფირფიტის ფარგლებს გარეთ რჩება.

მესამე, კომბინაციები, რომლებიც ჭაში სტერილურობას აღწევს, ორგანიზმში შეიძლება უშედეგო ან საზიანო აღმოჩნდეს. აზითრომიცინი მეთილენის ლურჯთან და რიფამპინი მეთილენის ლურჯთან ერთად ლაბორატორიული წყვილებია ლაბორატორიული ექსპოზიციის დონეებზე. ცხოველებში ფარმაკოკინეტიკისა და ადამიანებში კონტროლირებული კვლევების მონაცემების გარეშე არ არსებობს დადგენილი დოზა, ხანგრძლივობა ან სარგებლისა და რისკის თანაფარდობა. ვინც ვარიანტებს განიხილავს, ისინი კლინიცისტთან უნდა განიხილოს და გაეცნოს, როდის მოითხოვს მეთილენის ლურჯის გამოყენება სამედიცინო ზედამხედველობას, სანამ ჭურჭელში მიღებული მონაცემებიდან რაიმე დასკვნას გამოიტანს.

ამ ნაშრომებით გამყარებული ვიწრო დასკვნა ასეთია: მეთილენის ლურჯს აქვს განმეორებადი აქტივობა არამზარდი B. henselae JK53-ის მიმართ in vitro, მათ შორის ორი პრეპარატის ლაბორატორიულ კომბინაციებში; კომბინაციებისა და ბიოფილმიდან მიღებული უჯრედების ყველაზე ძლიერი შედეგები 2020 წლის კვლევიდან მოდის. ყველაფერი დანარჩენი, მათ შორის ის, აქვს თუ არა ამ აქტივობას მნიშვნელობა ადამიანებში ბარტონელოზისთვის, ჯერ გამოუცდელია.