EMB აგარი და MacConkey აგარი: ნიადაგების შერჩევა და ინტერპრეტაცია

სტუდენტი ერთი და იმავე წყლის ნიმუშს ორ ფირფიტაზე ათესავს. ერთზე ჩნდება მუქი კოლონიები მწვანე მეტალური ბზინვარებით. მეორეზე — მკვეთრი ვარდისფერი კოლონიები ბუნდოვანი ჰალოთი. ორივე ფირფიტა ერთი და იმავე სინჯარიდან დაინოკულირდა, გვერდიგვერდ ინკუბირდა და ერთსა და იმავე საათზე შეფასდა. სტუდენტი კითხულობს, რომელი ფირფიტაა სწორი.

ორივე ფირფიტა სწორია. ისინი სხვადასხვა კითხვას პასუხობენ. დაბნეულობა მაშინ ჩნდება, როდესაც ამ ორ ნიადაგს ნაწლავური ბაქტერიების ურთიერთჩანაცვლებად სკრინინგულ საშუალებებად განიხილავენ. მათი საერთო დანიშნულებაა გრამუარყოფითი ნაწლავური ორგანიზმების სელექცია და ლაქტოზის ფერმენტატორების არაფერმენტატორებისგან გამიჯვნა, თუმცა ამ მიზანს ისინი განსხვავებული ქიმიითა და განსხვავებული ვიზუალური ლოგიკით ახორციელებენ. როგორც კი ამ ორ ძირითად პრინციპს დაინახავთ, ფირფიტის შერჩევა და კოლონიების წაკითხვა რუტინული ხდება.

მოკლე პასუხი

EMB აგარი იყენებს ორ საღებავს, eosin Y-სა და methylene blue-ს, რომლებიც ერთდროულად ორ ფუნქციას ასრულებენ: თრგუნავენ გრამდადებითი ორგანიზმების ზრდას და ძლიერი მჟავაწარმომქმნელების გარშემო ილექებიან, რის შედეგადაც წარმოიქმნება მუქი კოლონიები, ხოლო Escherichia coli-ის კლასიკურ შემთხვევაში — მეტალური მწვანე ბზინვარება. MacConkey აგარი ამ ფუნქციებს ერთმანეთისგან აცალკევებს: ნაღვლის მარილები და crystal violet თრგუნავს გრამდადებით ორგანიზმებს, ლაქტოზა ფერმენტაციის სუბსტრატია, ხოლო neutral red მჟავას წარმოქმნას ვარდისფერი ან წითელი კოლონიებით აჩვენებს. თუ ამოცანაა E. coli-ის თვალსაჩინო სავარაუდო დემონსტრირება, EMB შესაბამისი არჩევანია. თუ ამოცანაა ლაქტოზის ფერმენტატორების არაფერმენტატორებისგან მკაფიოდ, ვარდისფერი და უფერული კოლონიების მიხედვით გამიჯვნა, განსაკუთრებით განავლის ან შარდის სამუშაო პროცესებში, MacConkey ჩვეულებრივ უფრო მარტივად იკითხება. მხოლოდ ფერის მიხედვით არცერთი ფირფიტა არ ახდენს ორგანიზმის იდენტიფიკაციას.

EMB: საღებავები, რომლებიც ერთდროულად არჩევენ და მიანიშნებენ

EMB-ის პრინციპი სელექციასა და ინდიკაციას ერთსა და იმავე მოლეკულებში აერთიანებს. ASM-ის eosin methylene blue agar-ის პროტოკოლი EMB-ს აღწერს როგორც სელექციურ და დიფერენციალურ ნიადაგს, სადაც საღებავების წყვილი მრავალი გრამდადებითი ორგანიზმის ზრდას თრგუნავს, ხოლო ლაქტოზის ფერმენტაცია იწვევს საღებავის შეწოვასა და დალექვას. Levine-ის სტანდარტული ფორმულაცია შეიცავს პეპტონს, ლაქტოზას, ფოსფატს, eosin Y-ს, methylene blue-სა და აგარს, როგორც ეს ჩამოთვლილია FDA BAM-ის Levine EMB agar-ის მეთოდში. გაითვალისწინეთ, რომ EMB-ის ძველ რეცეპტებში ზოგჯერ ლაქტოზასთან ერთად საქაროზაც ემატებოდა, ხოლო Levine EMB შეიცავს ლაქტოზას საქაროზის გარეშე, ამიტომ დააფიქსირეთ, რომელ ფორმულაციას იყენებს თქვენი ლაბორატორია.

EMB-ის წაკითხვა საღებავის ქცევის შეფასებას ნიშნავს. ლაქტოზის ინტენსიური ფერმენტაცია წარმოქმნის საკმარის მჟავას საღებავის ძლიერი დალექვისთვის, რაც E. coli-ს აძლევს მუქ ლურჯ-შავ ცენტრებს და, კლასიკურ შემთხვევაში, არეკლილ სინათლეში მწვანე მეტალურ ბზინვარებას. შედარებით სუსტი ფერმენტატორები, როგორიცაა Enterobacter და Klebsiella, ჩვეულებრივ იზრდებიან ვარდისფერი ან იისფერი მუკოიდური კოლონიების სახით ასეთი ბზინვარების გარეშე. არაფერმენტატორები, როგორიცაა Salmonella, Shigella და Proteus, ჩვეულებრივ იზრდებიან უფერული ან გამჭვირვალე კოლონიების სახით, რადგან ისინი არ წარმოქმნიან მჟავის იმ მკვეთრ მატებას, რომელიც საღებავების დალექვას იწვევს. გრამდადებითი ორგანიზმები, როგორც წესი, ითრგუნება, თუმცა დათრგუნვის ხარისხი განსხვავდება შტამისა და პროდუქტის მიხედვით. საღებავის მომზადების სრული ქიმია, მათ შორის ის, თუ რატომ იქცევა methylene blue თავდაპირველად კატიონურ საღებავად, საღებავების ფორმულაციების ცალკე განხილვას ეკუთვნის, ხოლო მიკროსკოპიის ზოგადი კონტექსტი მოცემულია შეღებვის მეთოდების ატლასში. ეს სტატია ფოკუსირებულია ფირფიტის შერჩევასა და წაკითხვაზე.

ზემოთ მოცემული ფიგურა ილუსტრაციულია. ის აჩვენებს მოსალოდნელ ვიზუალურ ლოგიკას: EMB-ზე მუქი ბზინვარე კოლონიები, ვარდისფერი მუკოიდური ტიპები და ღია ტიპები, ხოლო MacConkey-ზე — ვარდისფერი და ღია ტიპების დაპირისპირება. გამოიყენეთ ის ნიმუშის შესასწავლად, შემდეგ კი ყველა შეფასება გადაამოწმეთ კონტროლების ფოტოებთან და ზუსტად იმ ნიადაგის პროდუქტის ინსტრუქციასთან, რომელსაც თქვენს სამუშაო მაგიდაზე იყენებთ.

MacConkey: განცალკევებული ფუნქციები, უფრო მარტივი ვიზუალური წესი

MacConkey-ის პრინციპში თითოეულ ფუნქციას ცალკე ინგრედიენტი ასრულებს. ASM-ის MacConkey agar-ის პროტოკოლი ასევე აღწერს მას როგორც სელექციურ და დიფერენციალურ ნიადაგს, ხოლო FDA BAM-ის MacConkey agar-ის მეთოდი ჩამოთვლის ძირითად კომპონენტებს: პეპტონებს, ლაქტოზას, ნაღვლის მარილებს, მარილს, neutral red-ს, crystal violet-სა და აგარს. ნაღვლის მარილები და crystal violet გრამდადებითი ორგანიზმების წინააღმდეგ სელექციას უზრუნველყოფს. ლაქტოზა ფერმენტაციის სუბსტრატს წარმოადგენს. Neutral red მოქმედებს როგორც pH-ის ინდიკატორი და მჟავის წარმოქმნის ადგილებში ვარდისფრიდან წითელ შეფერილობამდე იცვლება, ზოგჯერ ძლიერი ფერმენტატორების გარშემო დალექილი ნაღველით.

წაკითხვის წესი განზრახ მარტივია: ვარდისფერი ნიშნავს ლაქტოზის ფერმენტატორს, ხოლო უფერული ან ღია — არაფერმენტატორს. E. coli ვარდისფრიდან წითლამდე შეფერილობას იღებს და ხშირად ნაღვლის ნალექის ჰალო აქვს. Klebsiella და Enterobacter ვარდისფერია და ხშირად მუკოიდური მათი კაფსულების გამო. Salmonella, Shigella, Proteus და მრავალი სხვა გრამუარყოფითი ჩხირი უფერულია. სასწავლო ლაბორატორიებისთვის კიდევ ერთი სარგებელი მნიშვნელოვანია: ნაღვლის მარილები ზოგადად ამცირებს Proteus-ის სვარმინგს, ამიტომ MacConkey-ზე იზოლირებული კოლონიების მიღება უფრო ადვილია, ვიდრე არასელექციურ ნიადაგებზე, თუმცა დათრგუნვა აბსოლუტური არ არის და არსებობს უმარილო ალტერნატივებიც, როდესაც სვარმინგის კონტროლი პრიორიტეტულია.

მოლეკულური მიზეზი, რის გამოც საღებავები ასე იქცევიან, მუხტსა და სტრუქტურას უკავშირდება. Methylene blue არის კატიონური ფენოთიაზინის საღებავი, რომლის სტრუქტურა და თვისებები ხსნის მის სწრაფვას ბაქტერიების მჟავე ზედაპირებისადმი; იგივე თვისება მოქმედებს მაშინაც, როდესაც ის EMB-ზე მჟავე ზონებში ილექება.

მოკლე შედარება

ცხრილი გამოიყენეთ როგორც გადაწყვეტილების მიღების პროცედურა. როდესაც სავარჯიშოს მიზანია სტუდენტებმა დაინახონ ფერმენტაციის სიძლიერის გრადიენტი ერთი მკვეთრი საბოლოო ნიშნით, ამას EMB აჩვენებს. როდესაც საჭიროა სწრაფი ბინარული გამიჯვნა ბიოქიმიურ დადასტურებამდე, ამას MacConkey აჩვენებს.

რომელი ნიადაგი რომელი ნიმუშისთვის

წყლის სავარჯიშოებში, რომლებიც სავარაუდო ფეკალური კოლიფორმების ან E. coli-ის ამოცნობას ისახავს მიზნად, EMB მიმზიდველია, რადგან მისი ბზინვარება ვიზუალურად გამორჩეულია. MacConkey ასევე გამოიყენება ნაწლავურ გრამუარყოფით ორგანიზმებთან და ისტორიულად წყალთან დაკავშირებულ კვლევებშიც გამოიყენებოდა, მაგრამ არცერთი ფირფიტა არ ცვლის მარეგულირებელი ორგანოს მიერ განსაზღვრულ წყლის კვლევის მეთოდს, რომელიც ტესტის მიხედვით შეიძლება ითვალისწინებდეს ისეთ ნიადაგებს, როგორიცაა modified mTEC ან MI. გადაამოწმეთ მეთოდი, რომლის დაცვაც თქვენს ლაბორატორიას მოეთხოვება.

განავლის ტიპის ნიმუშებში ფერმენტატორების არაფერმენტატორებისგან გასამიჯნად ამ ორიდან MacConkey ზოგადად უფრო გამოსადეგია. Salmonella-ს ან Shigella-ს პრაქტიკული კვლევისას განავლის ნიმუშებისთვის ჩვეულებრივ ემატება უფრო სელექციური ნაწლავური ნიადაგები, როგორიცაა XLD ან Hektoen enteric, ნაცვლად მხოლოდ MacConkey-ზე დაყრდნობისა.

კლინიკური სამუშაო პროცესის მიმბაძველ შარდის სასწავლო სავარჯიშოებში MacConkey გამოიყენეთ blood agar-თან ერთად. MacConkey უზრუნველყოფს გრამუარყოფითი ორგანიზმების ადრეულ გამიჯვნას, ხოლო blood agar ზრდის იმ ორგანიზმებსაც, რომლებსაც MacConkey თრგუნავს. ეს კომბინაცია სტანდარტულად გვხვდება შარდის კულტურის მოწყობის კლინიკურ აღწერებში.

კონცეფციის უშუალოდ სასწავლებლად გამოიყენეთ ორივე. EMB აჩვენებს, რომ ფერმენტაციის სიძლიერე მნიშვნელოვანია და ერთ მოლეკულას ორი ფუნქციის შესრულება შეუძლია. MacConkey ასწავლის მოდულურ დიზაინს: სელექტორი, სუბსტრატი და ინდიკატორი განცალკევებულია. სტუდენტები, რომლებიც ცნობილ E. coli-ს, ცნობილ Klebsiella aerogenes-სა და ცნობილ Salmonella-ს ორივე ნიადაგზე გვერდიგვერდ თესავენ, იშვიათად ურევენ ამ ორ ლოგიკას ერთმანეთში.

წაკითხვის შეცდომები, რომლებიც ყოველ სემესტრში მეორდება

ყველაზე გავრცელებული შეცდომაა ორგანიზმის მხოლოდ ფერის მიხედვით იდენტიფიკაცია. MacConkey-ზე ვარდისფერი შეიძლება იყოს E. coli, Klebsiella, Enterobacter ან სხვა ფერმენტატორი. უფერული შეიძლება იყოს Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ან სხვა არაფერმენტატორი. ფერი არის სკრინინგული ფენოტიპი, რომელიც შემდგომ დამადასტურებელ სამუშაოს მიმართულებას აძლევს, მაგალითად Gram stain-ს, oxidase-ს, ბიოქიმიურ პანელებს ან ინსტრუმენტულ იდენტიფიკაციას; ის სახეობის სახელი არ არის.

მეორე შეცდომაა ბზინვარების არარსებობის გადაჭარბებული ინტერპრეტაცია. ზოგი ნამდვილი E. coli-ის კოლონია, განსაკუთრებით იზოლირებული კოლონიები, EMB-ზე მცირე ან საერთოდ არანაირ მეტალურ ბზინვარებას არ წარმოქმნის. ბზინვარების არარსებობა E. coli-ს არ გამორიცხავს და მისი არსებობა მას არ ადასტურებს. ბზინვარება მხოლოდ სავარაუდო მინიშნებად განიხილეთ.

მესამე შეცდომაა სხვადასხვა ასაკის ფირფიტების შედარება. დაგვიანებულმა ლაქტოზის ფერმენტატორებმა ხანგრძლივი ინკუბაციის შემდეგ MacConkey-ზე შეიძლება ვარდისფერი შეფერილობა მიიღონ, რაც ფერმენტატორებისა და არაფერმენტატორების მკაფიო გამიჯვნას არღვევს. წაიკითხეთ შედეგი ლაბორატორიის მიერ განსაზღვრულ საათზე და შედეგთან ერთად დააფიქსირეთ ინკუბაციის დრო.

მეოთხე შეცდომაა შერეული ზრდის ერთ ორგანიზმად აღქმა. ვარდისფერი კოლონია უფერული კოლონიის გვერდით ორ ფენოტიპს აღნიშნავს და არა შუალედურ ვარიანტს. აირჩიეთ კარგად იზოლირებული კოლონიები და თითოეული მორფოტიპი ცალ-ცალკე დაამუშავეთ. მუკოიდური ტექსტურაც მსგავს შეცდომას იწვევს: როგორც Klebsiella, ისე Enterobacter შეიძლება მუკოიდურად გამოიყურებოდეს, ამიტომ მხოლოდ კაფსულა სახელის განსაზღვრისთვის არასაკმარისია. ორგანიზმი, რომელსაც ადრე Enterobacter aerogenes-ის სახელით ასწავლიდნენ, ახლა Klebsiella aerogenes-ად არის კლასიფიცირებული, რაც ხსნის, რატომ შეიძლება ძველი ცხრილები და ახალი აღნიშვნები ერთმანეთს არ ემთხვეოდეს.

კონტროლები და დასკვნითი წესი

ყოველ სესიაზე გამოიყენეთ ფოტოდოკუმენტირებული ან ახალი კონტროლები: E. coli ძლიერი ფერმენტატორის რეაქციისთვის, Klebsiella aerogenes მუკოიდური ფერმენტაციისთვის კლასიკური ბზინვარების გარეშე, Salmonella-ს შტამი უფერული არაფერმენტატორის რეაქციისთვის და Staphylococcus aureus თქვენს კონკრეტულ პროდუქტზე გრამდადებითი ორგანიზმების დათრგუნვის დასადასტურებლად. შტამის ნომრები და მისაღები კრიტერიუმები შეადარეთ მწარმოებლის ინსტრუქციას, რადგან სელექციურობა იცვლება ნაღვლის, crystal violet-ისა და საღებავის შემცველობის მიხედვით.

სამუშაო მაგიდასთან ერთი წინადადება დაიმახსოვრეთ. EMB იყენებს საღებავებს, რომლებიც ერთდროულად არჩევენ და მიანიშნებენ, რაც იძლევა E. coli-ის მკვეთრ სიგნალს, თუმცა წაკითხვას უფრო ნიუანსურს ხდის. MacConkey სელექციას ინდიკაციისგან აცალკევებს, რაც იძლევა მარტივ ვარდისფერი და ღია კოლონიების გამიჯვნას, თუმცა ფერმენტაციის ნაკლებ დეტალს აჩვენებს. აირჩიეთ ნიადაგი, რომლის პრინციპიც დასმულ კითხვას შეესაბამება, ფერი სათანადო ტესტებით დაადასტურეთ და ეს ორი ფირფიტა კონკურენციის ნაცვლად ერთმანეთის შემავსებელი გახდება.