Mgbe methylene blue na-etinye aka na nnwale e ji atụ ya

Otu ụlọ nyocha na-azụ embrayo zebrafish n'ime methylene blue n'ogo a na-ejikarị azụ ha, wee tụọ metabolism n'ụzọ abụọ. N'ụbọchị mbụ, ihe nyocha Seahorse na-egosi na oriri oxygen na-arị elu. N'ụbọchị nke anọ na nke ise, efere nnwale Alamar Blue na-egosi na mmefu ike na-agbada. Otu ihe e ji agba agba, otu ahịrị agbụrụ azụ, ma nkwubi okwu ndị megidere ibe ha. Mgbe ahụ, nnwale njikwa a na-adịghị elebara anya na-apụta: oghere efere nwere methylene blue na reagent Alamar Blue, ma na-enweghị azụ ọ bụla, na-enyekwa ìhè dị ala karịa reagent naanị ya. Akụkụ nke nsonaazụ ahụ sitere n'usoro ihe ndụ. Akụkụ ọzọ bụ ihe e ji agba agba na-enye onwe ya akara n'ule nke ya. Nkewa ahụ, nke e dekọrọ na nnyocha Communications Biology nke 2025 banyere methylene blue na zebrafish na-etolite, bụ ụdị ndabichi methylene blue na nnwale a na-ahụkarị, ọ bụkwa ya mere ihe e ji agba agba ndị na-arụ ọrụ redox ji achọ nnwale njikwa ndị ngwakọta nnwale nkịtị na-adịghị achọ.

Ihe nnwale resazurin na-egosi n'ezie

Alamar Blue bụ aha azụmahịa maka ngwọta resazurin, ya mere ndabichi methylene blue na Alamar Blue na ndabichi methylene blue na nnwale resazurin na-akọwa otu nsogbu ahụ. Resazurin e mere oxidation na-acha anụnụ anụnụ, ọ na-enyekwa fluorescence pere mpe. Sel ndị metabolism ha na-arụ ọrụ na-eme ka ọ belata gaa na resorufin, nke na-acha pink ma na-enye fluorescence siri ike n'akụkụ mkpali 560 nm na mwepụta 590 nm. Dabere na usoro nnwale microplate nke onye nrụpụta, mpaghara a pụrụ iji bụ ihe dịka mkpali 530 ruo 570 nm na mwepụta 580 ruo 610 nm. Ọ bụrụ na mbelata ahụ aga n'ihu, resorufin na-agbanwe gaa na dihydroresorufin, nke fluorescence ya dị obere. Ya mere, itinye sel karịrị akarị n'oghere efere ma ọ bụ ịhapụ nnwale ahụ ogologo oge na-eme ka ahịrị nhazi atụ gbagọọ gbadaa n'akụkụ elu ya.

Elektrọn ndị ahụ na-esikarị na NADH na NADPH site na reductase na diaphorase ndị dị n'ime sel, na cytosol, microsome, na mitochondria. Nke ahụ na-eme ka ọgụgụ ahụ bụrụ ikike mbelata jikọtara ọnụ, ọ bụghị ọnụ ọgụgụ sel ndị dị ndụ, ọ bụghịkwa atụ kpọmkwem nke mitochondria. Mgbaàmà dị elu nwere ike ịpụta na sel dị ọtụtụ, na ntinye elektrọn maka mbelata n'otu sel dị elu, ma ọ bụ ha abụọ. Ngwakọta na-agbanwe ụzọ NADH si aga na-agbanwe mgbaàmà ahụ n'egbughị ọbụna otu sel. Buru ahịrịokwu ahụ n'uche, n'ihi na ịgbanwe ụzọ NADH si aga bụ otu n'ime ihe methylene blue na-eme.

Ụzọ ndabichi abụọ, otu mgbaàmà belatara

Methylene blue na-agbagọ ọgụgụ resazurin site n'ụzọ abụọ nọọrọ onwe ha, nke ọ bụla n'ime ha naanị ya na-eme ka fluorescence a na-ahụ belata.

Ụzọ 1 metụtara ìhè. Methylene blue na-amịkọrọ ìhè nke ukwuu n'akụkụ uhie, ebe eriri monomer ya dị nso na 660 ruo 665 nm, ebe ntakịrị ịrị elu nke dimer dị nso na 607 ruo 610 nm, ọdụ ya na-agbatịkwa azụ ruo n'akụkụ mwepụta resorufin dị ihe dịka 590 nm. Ihe e ji agba agba dị n'ụzọ ìhè na-amịkọrọ ụfọdụ ìhè mkpali ma na-amịkọrọ ọzọ ụfọdụ ìhè fluorescence e wepụtara. Nke a bụ mmetụta nzacha dị n'ime nke na-ebelata ìhè oghere efere ọbụna mgbe mmepụta resorufin agbanweghị. Ụdịdị ìhè ahụ na-agbanwekwa dịka ọnọdụ ihe e ji agba agba si dị: nyocha ihe ndị mejupụtara ụdịdị ìhè methylene blue n'ime mmiri na ngwọta cyclodextrin na-ekewa monomer, dimer, na ngwakọta onye nnabata na onye ọbịa dịka ụdị atọ nwere ọnụọgụ amịkọrọ ìhè dị iche iche site na 500 ruo 700 nm. Ya mere, nha njehie metụtara ìhè na-agbanwe dabere na ogo ngwakọta, nchịkọta ụmụ irighiri ihe, na njikọ ha. N'ime nnwale, jiri nnwale mgbake resorufin agbakwunyere nke a kọwara n'okpuru kewapụ mbelata ìhè nkịtị na mbelata fluorescence sitere na mmekọrịta ụmụ irighiri ihe, n'ihi na ụzọ idozi ha dị iche.

Ụzọ 2 bụ asọmpi redox. Methylene blue e mere oxidation na-anabata elektrọn site na NAD(P)H iji mepụta leuco methylene blue na-enweghị agba. Oxygen molekụla na-eme oxidation ya ọzọ ka ọ laghachi n'ụdị anụnụ anụnụ, ma n'otu oge ahụ na-emepụta ihe sitere na mbelata oxygen, gụnyere hydrogen peroxide. Oge ọ bụla okirikiri ahụ zuru, ọ na-eji ikike mbelata nke gaara eme ka resazurin belata, ọ na-erikwa oxygen ma na-emepụta peroxide n'akụkụ. Ya mere, mgbaàmà Alamar Blue belatara nwere ike ịpụta na elektrọn gara n'okirikiri methylene blue kama ịbanye na resorufin. Efere nnwale na-agụ nke ahụ dịka metabolism belatara, n'agbanyeghị ihe sel ndị ahụ mere. Otu kemịkal ahụ na-akọwakwa ọnyà na-eme n'ụzọ megidere nke a n'igwe atụ oxygen: mgbe oxygen mere oxidation ọzọ nke ihe e ji agba agba e belatara, nke ahụ na-akpata oriri oxygen site na kemịkal ọbụna mgbe ihe ndụ adịghị. Ya mere, nnwale ntụaka nwere ihe e ji agba agba kwesịrị ịdịkwa na atụ iku ume, dịka ntụnyere ọgụgụ oxygen, ATP, na ikike eletrik n'ofe akpụkpọ sel si kọwaa maka ọnọdụ mitochondria.

Mgbaàmà gbanwere na usoro ihe ndụ gbanwere nwere ike ịbụ eziokwu n'otu oge

Nnyocha zebrafish ahụ bara uru kpọmkwem n'ihi na ọ naghị anabata nkwubi okwu dị mfe nke na-ekwu na ọ bụ naanị otu n'ime ha. Mgbanwe n'usoro ihe ndụ bụ eziokwu: oriri oxygen nke ntọala rịrị elu n'embrayo dị ụbọchị 1 n'ogo ngwakọta abụọ e ji azụ ha; iku ume jikọtara na ATP rịrị elu n'ogo ngwakọta nke dị ala; ikike eletrik n'ofe akpụkpọ sel a tụrụ site na ihe nchọpụta JC-10 rịrị elu n'ụbọchị nke abụọ; transcript nke ngwakọta protein mitochondria belatakwara n'ụbọchị nke mbụ na nke anọ. Mgbagọ sitere na nnwale bụkwa eziokwu: azụ ndị a sachara ugboro atọ tupu usoro Alamar Blue ka nwere ntụpọ anụnụ anụnụ a na-ahụ anya n'isi, n'ọnụ, na mpaghara isi ísì. Oghere efere na-enweghị sel, ma nwee ihe e ji agba agba na reagent, tufukwara obere fluorescence nke dị mkpa n'ụzọ ọnụ ọgụgụ n'onwe ha. Mbelata Alamar Blue n'ahụ azụ n'ụbọchị nke anọ na nke ise karịrị mmetụta a hụrụ n'oghere na-enweghị sel, ya mere ndị dere nnyocha ahụ ghọtara nsonaazụ ya dịka ezigbo mgbanwe metabolism e lere site na enyo gbagọrọ ntakịrị. Nke ahụ bụ ụzọ ziri ezi isi ghọta ya. Ihe na-agagharị n'okirikiri redox nke na-amịkọrọkwa ìhè ga na-akpaghasịkarị ụzọ a na-enyocha na kemịkal ihe na-enye mgbaàmà n'otu oge. Ọrụ nnwale njikwa bụ ịtụ nha onyinye nke ọ bụla, ọ bụghị ikwu na otu n'ime ha adịghị adị. Ihe mmụta yiri nke a sitere n'ọrụ njikọ cyclodextrin: mgbe molekụla onye nnabata jidere ihe e ji agba agba, ịcha agba na mkpali ịnabata glucose belatara ọnụ. Nke ahụ na-egosi na mmetụta metabolism chọrọ mmekọrịta kpọmkwem na ihe e ji agba agba, kama ọgbaghara redox gbasasịrị agbasa. Ijikọta ọgụgụ anụ ahụ nke ihe e ji agba agba na ọgụgụ ọrụ ya bụ kpọmkwem ụzọ e si ekewapụ usoro ọrụ na mgbagọ nnwale, ntuziaka maka ịgụ nkwupụta metabolism dabere n'ihe e ji agba agba na-akọwakwu ụzọ omume ahụ.

Nnwale njikwa ndị na-ekewapụ ha

Mee ndị a tupu ịkọwa nsonaazụ methylene blue ọ bụla sitere na efere resazurin. Ogo ngwakọta, mmiri nzụlite, oge nkụnye, na ìhè a na-enye ga-adakọ kpọmkwem na nnwale sel, n'ihi na ụzọ niile a kọwara n'elu dabere na ha.

Nnwale njikwa 3 na 4 bụ ụzọ abụọ ọtụtụ akwụkwọ nnyocha na-ahapụ, ọtụtụ akwụkwọ banyere methylene blue na-achọkwa. Nnwale njikwa 3 na-achọpụta kemịkal, nnwale njikwa 4 na-achọpụta mmetụta ìhè, ha abụọ na-edokwa oke mgbagọ nnwale tupu e kwuo ihe ọ bụla banyere usoro ihe ndụ.

Ọgụgụ ndị nọọrọ onwe ha, nke ọ bụla nwere ihe a ga-akpachara anya banyere ya

Ọ dịghị otu nnwale nke abụọ nwere ike ikwenye nke mbụ n'onwe ya. Ọgụgụ ọ bụla nke usoro ya nọọrọ onwe ya na-agbanahụ otu ụzọ ndabichi ma ka na-emeghe nye ụzọ ọzọ, ya mere họrọ ngwakọta nke adịghị ike ha na-adịghị adakọ. Tebụl nhọrọ nnwale maka ngwakọta na-arụ ọrụ redox na-akọwa echiche dị n'ịhọrọ ha abụọ, ntuziaka ihe nchọpụta ikike eletrik n'ofe akpụkpọ sel na-akọwakwa ihe a ga-akpachara anya banyere fluorescence n'ụzọ zuru ezu.

Atụ oriri oxygen nke Seahorse na-eso elektrọn ruo na oxygen kama ruo na resorufin, nke na-ezere kemịkal ihe na-enye mgbaàmà kpamkpam. Ma ihe e ji agba agba na-erikwa oxygen site na kemịkal, ya mere a ga-enwerịrị nnwale ntụaka nwere ihe e ji agba agba, na-enweghị mitochondria, n'ime mmiri nzụlite zuru ezu. Nnwale ATP luciferase na-eji ìhè sitere na mmeghachi ihe ndụ kama fluorescence resorufin, ya mere ha na-ezere ma njikọ mmetụta ìhè ma asọmpi reductase. Ihe ha na-atụ, n'agbanyeghị nke ahụ, bụ nguzozi ATP dị n'oge ahụ kama ọsọ mmepụta ATP. Ihe nchọpụta ikike eletrik n'ofe akpụkpọ sel dịka TMRM ma ọ bụ JC-10 na-aza ma ọdịiche ụgwọ eletrik ahụ ka dị, ma ha na-enyekwa fluorescence n'otu mpaghara ìhè a na-ahụ anya nke ihe e ji agba agba na-amịkọrọ. Ya mere, ntụpọ anụnụ anụnụ fọdụrụ na-eme ka ha sie ike ịkọwa, ha chọkwara nnwale ntụaka nwere naanị ihe e ji agba agba n'ogo ọ bụla. Atụ transcript nke obere akụkụ ngwakọta protein iku ume na-ezere mmetụta ìhè kpamkpam ma na-achịkọta mgbanwe ruo ọtụtụ awa, nke na-agbakwunye ozi na ọgụgụ efere nke na-ewe nkeji.

Ya mere, ihe kacha nta a pụrụ ịtụkwasị obi maka nkwupụta metabolism banyere methylene blue bụ: nsonaazụ resazurin nwere nnwale njikwa 1 ruo 4, tinyere otu atụ ikpeazụ na-abụghị resazurin nke dabere n'ụkpụrụ anụ ahụ dị iche, tinyere nkọwa ma mgbanwe ahụ na-egosi ọnụ ọgụgụ sel, ntinye elektrọn maka mbelata n'otu sel, ma ọ bụ ha abụọ. Ihe na-erughị nke a na-ahapụ onye na-agụ ya n'enweghị ike ịmata ọdịiche dị n'etiti metabolism belatara na oghere efere ìhè ya belatara.

Mpempe ọrụ njikwa ndabichi

Detuo mpempe ọrụ a n'ime akwụkwọ ndekọ ụlọ nyocha maka nnwale ọ bụla na-ejikọta ihe e ji agba agba na ihe na-enye mgbaàmà redox. Ọ bụ ihe ọrụ mbụ e mepụtara maka isiokwu a: dejupụta otu ahịrị maka ogo ngwakọta ihe e ji agba agba ọ bụla.

A. Ụzọ mgbaàmà. Maka ogo ngwakọta ọ bụla, dekọọ: ọnọdụ monomer ma e jiri ya tụnyere dimer a tụrụ anya ya (ogo micromolar dị ala ma e jiri ya tụnyere ọtụtụ iri micromolar na karịa), amịkọrọ ìhè nke ihe niile dị n'oghere efere n'ikpeazụ na 590 nm n'oghere na-enweghị sel, na pasent mgbake resorufin agbakwunyere. Ọ bụrụ na mgbake daa n'okpuru ihe dịka 90 percent, were uru fluorescence niile n'ogo ahụ dịka ndị mmetụta ìhè belatara, ọ bụghị dịka atụ kpọmkwem nke usoro ihe ndụ.

B. Nlele kemịkal. Dekọọ fluorescence nke ihe e ji agba agba na reagent n'oghere na-enweghị sel dịka pasent nke uru ntọala reagent naanị ya n'oge ọgụgụ ọ bụla. Ọ bụrụ na ọdịiche ahụ arị elu ka oge na-aga, ihe e ji agba agba na usoro na-enye mgbaàmà na-emekọrịta n'oge nnwale, ọgụgụ e mere naanị na njedebe ga-eduhiekwa. Tụlee ọgụgụ n'oge dị iche iche iji soro ọsọ mgbanwe ahụ, ma ọ bụ jiri ihe ọzọ na-enye mgbaàmà.

C. Nlele nkwenye usoro ihe ndụ. Kpọọ aha ọgụgụ nọọrọ onwe ya a họọrọ maka nnwale a, nnwale ntụaka nke ihe e ji agba agba maka ya, na nsonaazụ a tụrụ anya ya ma ọ bụrụ na nsonaazụ resazurin bụ eziokwu. Ezigbo mbelata metabolism kwesịrị ime ka atụ ikpeazụ nọọrọ onwe ya gbanwee n'ụzọ kwekọrọ na ya. Ọ bụrụ na atụ ikpeazụ ahụ ekwekọghị, atụkwasịla nsonaazụ ọ bụla obi ugbu a; megharịa atụmatụ nnwale kama ịchọta nkezi nke ha abụọ.

D. Ahịrịokwu nkwubi okwu. Dee otu ahịrịokwu n'ụdị a: n'ogo na ọkwa e kwuru, mgbaàmà resazurin gbanwere site n'ọnụọgụ e kwuru, nke ọnụọgụ e kwuru n'ime ya bụ mgbagọ nnwale na-enweghị sel, atụ ikpeazụ nọọrọ onwe ya (kwekọrọ ma ọ bụ ekwekọghị). Ọ bụrụ na oghere ndekọ ọ bụla dị efu, nnwale ahụ agwụbeghị.

Methylene blue ka bụ ihe nchọpụta metabolism bara uru, ọrụ zebrafish ahụ na-egosikwa ezigbo mmetụta mitochondria n'ogo ọtụtụ ụlọ ọrụ na-awụfu n'ọwa mmiri kwa ụbọchị. Naanị ihe e ji agba agba ahụ na-achọ bụ ka e jiri ngwá ọrụ ọ na-apụghị imetụta tụọ ya. Nye ya oghere efere nwere naanị ihe e ji agba agba, nnwale mgbake ihe agbakwunyere, na otu ọgụgụ dabere n'ụkpụrụ anụ ahụ dị iche, ndabichi ahụ akwụsị ịbụ ọnyà wee bụrụ ihe a pụrụ ịtụ ma nye ọnụọgụ.