Edemede
Methylene blue na autophagy: AMPK, mTOR, na nnwale mkpụrụ ndụ akwara ozi
Were ya na ị na-eme nnwale mkpụrụ ndụ, tinye methylene blue, wee hụ eriri protein a na-akpọ LC3-II ka ọ na-agba ọchịchịrị karịa na blot gị. Ọ dị mfe ikwupụta na ogige kemịkalụ ahụ “na-akwalite autophagy” wee gaa n'ihu. Nkọwa ahụ bụ nke e mere tupu oge ya. Eriri LC3-II gbara ọchịchịrị karịa nwere ike ịpụta na mkpụrụ ndụ na-emepụta akpa nta ndị ọzọ maka ikpochapụ ihe, ma ọ bụ na akpa nta ndị ahụ na-agbakọta n'ihi na nzọụkwụ ikpochapụ ihe egbochila. Nkọwa abụọ ahụ na-atụ aka n'akụkụ ndị megidere ibe ha, akwụkwọ nyocha methylene blue na mkpụrụ ndụ akwara ozi nwekwara ihe atụ nke ụdị ihe akaebe abụọ ahụ. Edemede a na-akọwa ihe a tụrụ n'ezie, otu ule n'otu oge.
Macroautophagy, ụdị a mụrụ ebe a, bụ usoro mkpụrụ ndụ ji emegharị ọtụtụ ihe ka e jiri ha ọzọ. Akpa akpụkpọ a na-akpọ phagophore na-eto gburugburu protein na akụkụ nta mkpụrụ ndụ ndị merela agadi, mechie ghọọ autophagosome, jikọta na lysosome, a na-akụrisịkwa ihe ndị o bu wee wepụta ha ka e jiri ha ọzọ. Mkpụrụ ndụ akwara ozi na-adabere n'usoro a n'ihi na ha anaghị ekewa, ha enweghịkwa ike ibelata oke akụkụ ndị mebiri emebi site na nkewa. Mgbe usoro imegharị ihe kwụsịrị, ihe mkpofu na-agbakọta. Mgbe ọ na-arụ ọrụ, mkpụrụ ndụ na-enwetaghachi ihe ọ ga-eji wuo akụkụ ya mgbe ọ nọ n'okpuru nrụgide.
Ihe otu nnwale hippocampus gosiri
Ọmụmụ bụ isi gbasara ịmalite usoro ahụ ji mkpụrụ ndụ HT22 sitere na hippocampus òké, nke a tinyere n'okpuru nrụgide site n'ịnapụ ha serum ruo awa 24. Ọnọdụ a na-ewepụ ihe ndị na-akwalite uto na mgbaàmà ndị na-akwado ịdị ndụ mkpụrụ ndụ, na-akpalikwa apoptosis na autophagy. Ndị nyocha ahụ kọrọ na methylene blue belatara ọnwụ mkpụrụ ndụ n'ụzọ dabere n'oke e ji mee nnwale, nakwa na ihe ịrịba ama macroautophagy so nchedo a.
Ihe nrịbama ndị ahụ gosiri mgbanwe doro anya. Agba LC3B nke gbasasịrị n'ime mkpụrụ ndụ gbanwere ka ọ bụrụ ntụpọ ndị gbara isi mkpụrụ ndụ gburugburu, malite n'ihe dị ka 20 nM methylene blue; nzaghachi LC3-I na LC3-II kacha ike dị nso na 1 μM. LC3B-I na LC3B-II abụọ mụbara n'ụzọ dabere n'oke e ji mee nnwale na oge. Nke dị mkpa bụ na ndị otu ahụ gara otu nzọụkwụ karịa naanị blot LC3 nke otu oge. Ha tinyere 10 μM chloroquine, nke na-egbochi mkpochapụ site na lysosome, wee hụ LC3-II ka ọ dị elu na p62 ka ọ kwụsie ike n'ime mkpụrụ ndụ ndị e tinyere methylene blue. Ụkpụrụ ahụ na-akwado mmebi na nnọchi ihe dabere na lysosome, kama naanị nchịkọta ihe. Ha gosikwara na chloroquine kagburu akụkụ nke mmetụta igbochi apoptosis, nke jikọtara nchedo ahụ na ụzọ autophagy na lysosome n'ụdị nnwale a.
Nsonaazụ nnyefe mgbaàmà bụ akụkụ a na-ehiekarị ihie mgbe a na-ehota ya. Nnyefe mgbaàmà AMPK, nke a tụrụ site na AMPK agbakwunyere otu phosphate na ACC agbakwunyere otu phosphate nke ọ na-emetụta n'ihu n'usoro ahụ, mụbara n'awa 12 na 24 n'ụzọ dabere n'oke e ji mee nnwale. Ihe mgbochi AMPK a na-akpọ Compound C, nke e tinyere na 20 μM n'ime awa 4 ikpeazụ, belatara ma mgbakwunye phosphate na ACC ma ịrụ ọrụ LC3. N'aka nke ọzọ, mTOR agbakwunyere otu phosphate egosighị mbelata a pụrụ ịchọpụta. Ya mere, n'ime mkpụrụ ndụ hippocampus nọ n'okpuru nrụgide, nchọpụta ahụ bụ ịmalite usoro jikọtara na AMPK site n'ụzọ nke yiri ka ọ naghị adabere na mTOR. A hụkwara otu ụkpụrụ ahụ n'ime òké dị ndụ, ebe iji methylene blue kpalitere ihe nrịbama macroautophagy na cortex na hippocampus.
Ịmalite usoro abụghị ngafe e mechara
N'ebe a, ọdịiche dị n'etiti echiche ndị a kacha mkpa. Ịmalite usoro pụtara na ihe ndị na-arụ ọrụ na mbido usoro ahụ na-emepụta autophagosome ndị ọzọ. Ngafe, ma ọ bụ flux, pụtara na ihe ndị e bu na-agafe ụzọ ahụ dum: ikewapụ ha n'ime akpa, ntozu, njikọ na lysosome, mmebi, na imegharị ha ka e jiri ha ọzọ. Mmụba LC3-II ọ bụla bụ ihe akaebe gbasara ịmalite usoro ruo mgbe ule ngafe gosiri na akụkụ ndị ọzọ nke njem ahụ mere.
Ule ngafe a na-ejikarị atụ LC3-II ma mgbe e nwere ma mgbe e nweghị mgbochi lysosome nke obere oge, dịka bafilomycin A1 ma ọ bụ chloroquine. Ọ bụrụ na ihe e tinyere na-eme ka mmepụta dị ngwa n'ezie, igbochi mbibi kwesịrị ime ka LC3-II rịa elu karịa. Ihe nrịbama mCherry-GFP-LC3 ejikọtara ọnụ na-enye ụzọ nke abụọ isi lelee ya: akụkụ ndị ahụ na-enwu edo edo tupu ha ejikọta na lysosome, na-enwukwa naanị uhie mgbe acidity kwụsịrị mgbaàmà GFP. Ya mere, ntụpọ ndị ọzọ na-enwu naanị uhie na-akwado ngafe gaa n'ime autolysosome nwere acidity. Mbelata protein p62 nwere ike ịkwado mmebi na nnọchi ihe ndị e bu, mana a ga-eburu n'uche na nrụgide na-emetụtakwa idepụta ozi mkpụrụ ndụ ihe nketa p62 n'onwe ya, a kwesịkwara ịlele nke a n'ọkwa mRNA.
Ndepụta nyocha dị n'okpuru na-ejikọta ule ọ bụla e ji mee nyocha ndị a na ihe ọ na-atụ na ihe ọ na-apụghị igosi naanị ya. Ndị na-agụ akwụkwọ nwere ike iji ya ọzọ nyochaa nkwupụta macroautophagy ọ bụla n'ọdịnihu, gụnyere arụmụka gbasara ibu ọnụ na ogologo ndụ ndị na-eji ihe nrịbama ndị a.
| Ule | Ihe ọ na-atụ | Ihe ọ na-apụghị igosi naanị ya |
|---|---|---|
| Ọkwa LC3B-I | Ogo nchịkọta ụdị mbido dị na cytosol nke dị njikere maka mgbakwunye lipid | Ọrụ autophagy; mmepụta na nhazi na-agbanwekwa ya |
| Ọkwa LC3B-II | Oke LC3 jikọtara na akpụkpọ akụkụ ndị na-eme autophagy | Ngafe e mechara; mmụba nwere ike ịpụta mmepụta dị ngwa karịa ma ọ bụ mkpochapụ egbochiri |
| Ntụpọ LC3 na nchịkọta gburugburu isi mkpụrụ ndụ | Mgbanwe nkesa LC3 gaa n'akụkụ ndị yiri akpa nta | Ụzọ mgbanwe ahụ si aga; foto otu oge enweghị ike ịmata ọdịiche n'etiti ngwangwa na nchikọta n'ihi mgbochi |
| LC3-II mgbe e nwere megide mgbe e nweghị chloroquine ma ọ bụ bafilomycin A1 | Ma autophagosome ọhụrụ ka na-emepụta mgbe e gbochiri mkpochapụ | Mmebi zuru ezu nke ihe ndị e bu; a chọrọ iji ihe mgbochi ahụ ruo obere oge e doziri nke ọma |
| Ọkwa protein p62 | Mmebi na nnọchi protein njikọ ihe e bu, nke a na-ebibikarị n'ime autolysosome | Ngafe naanị ya; ụzọ nzaghachi nrụgide na-achịkwa idepụta ozi mkpụrụ ndụ ihe nketa p62 |
| Ihe nrịbama mCherry-GFP-LC3 ejikọtara ọnụ | Ngafe gaa n'ime autolysosome nwere acidity (mgbanwe site na edo edo gaa na naanị uhie) | Mmebi zuru ezu nke ụdị ihe ọ bụla e bu |
| Phospho-AMPK na phospho-ACC | Ịrụ ọrụ ihe na-achọpụta nrụgide ume na ihe ọ na-ebute | Na autophagy kpatara mmetụta ịdị ndụ; AMPK na-achịkwa ọtụtụ alaka usoro mgbanwe kemịkalụ |
| Phospho-mTOR, p70S6K, 4EBP1 | Ọrụ ụzọ nnyefe mgbaàmà uto nke na-egbochi autophagy | Ngafe; ndị a bụ mgbaàmà ikike n'akụkụ mbido usoro ahụ, ọ bụghị ihe ndị na-atụ mkpochapụ |
Rịba ama otu ọnyà okwu nke tebụl ahụ na-enyere aka izere. ACC agbakwunyere otu phosphate bụ ụdị nke a gbochiri ọrụ ensaịm ya. Mmụba ya na-egosi ihe AMPK na-ebute, ọ bụghị ịrụ ọrụ ACC.
Ahịrịokwu “igbochi macroautophagy kagburu nchedo mkpụrụ ndụ akwara ozi” chọkwara otu izi ezi ahụ. N'ụdị nnwale HT22, ọ pụtara na itinye aka n'ụzọ autophagy na lysosome wepụrụ uru ịdị ndụ methylene blue nyere mgbe a napụrụ mkpụrụ ndụ serum. Ọ na-akwado na autophagy dị mkpa ma ọ bụ na-enye aka n'ime efere nnwale ahụ. Ọ naghị egosi na autophagy bụ naanị usoro nchedo ogige kemịkalụ ahụ, ọ naghị egosi na chloroquine na-arụ ọrụ naanị site na autophagy, a ga-achọkwa ịgbanwe ọrụ mkpụrụ ndụ ihe nketa ATG5, ATG7, ma ọ bụ ULK1 iji mee ka nkwupụta gbasara ihe kpatara nsonaazụ ahụ sie ike.
Ụzọ abụọ na-abanye n'otu usoro ọrụ
Maapụ dị mfe na-enyere aka. Nrụgide ume na-ebuli AMPK, AMPK na-eme ka nchịkọta protein ULK1 rụọ ọrụ, autophagy amalitekwa. Ihe ndị na-akwalite uto na ihe nri na-ebuli mTORC1, mTORC1 na-egbochi ULK1, autophagy anaghịkwa amalite. N'akụkụ usoro na-esote ULK1, nchịkọta protein Beclin-1 na VPS34 na-amalite nhazi phagophore, a na-agbakwunye lipid na LC3-I ka ọ ghọọ LC3-II, autophagosome emechie, jikọta na lysosome, a na-akụrisịkwa ihe ndị o bu ka p62 na-emebi ma na-anọchi.
Eserese ahụ na-edebe nchọpụta methylene blue ọ bụla na maapụ a: nsonaazụ hippocampus n'akụkụ alaka AMPK, nsonaazụ mkpụrụ ndụ mmalite n'akụkụ alaka mTOR.
Nkọwa a na-edozi ihe yiri esemokwu na ọmụmụ Xie nke abụọ. N'ime mkpụrụ ndụ mmalite akwara ozi oke ndị na-amụba site na nkewa, nnwale ọzọ chọpụtara na 5 μM methylene blue gbochiri mmụba ma kwalite ọnọdụ ezumike na-enweghị nkewa. Mkpụrụ ndụ ndị gosiri Ki67 belatara n'ụbọchị 1 na 3, ebe usoro ịghọ mkpụrụ ndụ akwara ozi n'ime ndị banyelarị n'ụzọ ahụ anọgideghị emebi. N'ebe ahụ, usoro ahụ si na mbelata nnyefe mgbaàmà mTOR arụ ọrụ: mTOR niile na mTOR agbakwunyere otu phosphate belatara, yana mbelata mmepụta p70S6K na 4EBP1, na mbelata cyclin E1, B1, D1, na D2. Àgwà kacha pụta ìhè bụ ọnọdụ ezumike na-enweghị nkewa nke mkpụrụ ndụ mmalite, nke ndị ode akwụkwọ jikọtara na igbu oge ịka nká mkpụrụ ndụ, ọ bụghị ịzọpụta mkpụrụ ndụ hippocampus nọ n'okpuru nrụgide.
Enweghị esemokwu n'etiti akwụkwọ abụọ ahụ. AMPK na mTOR bụ ihe ndị na-ejikọta mgbaàmà dịka ọnọdụ si dị, ọ bụghị ihe ọkụ/gbanyụọ na-anọ otu mgbe niile. Mkpụrụ ndụ yiri mkpụrụ ndụ akwara ozi nke nọ n'okpuru nrụgide nwere ike ime ka AMPK rụọ ọrụ n'enweghị mgbochi mTOR a pụrụ ịtụ, ebe mkpụrụ ndụ mmalite nke ihe na-akpalite nkewa na-akwọ nwere ike ịzaghachi otu ogige kemịkalụ ahụ site n'ibelata ọrụ uto dabere na mTOR. Ụdị mkpụrụ ndụ, ọnọdụ nrụgide, ịta kemịkalụ, na oge e mere nha na-ekpebi alaka kacha emetụta nsonaazụ. Nke a bụkwa ihe mere mmetụta methylene blue n'ume mitochondria na redox ji bụrụ akụkụ nke otu nkọwa ahụ: dịka nyocha nchịkọta gbasara usoro nchedo mkpụrụ ndụ akwara ozi na-akọwa, ogige kemịkalụ ahụ na-arụ ọrụ dịka ihe ọzọ na-ebu elektrọn, na-akpalite nnyefe mgbaàmà igbochi oxidation na apoptosis, na-egbochi MAO na NOS, ma na-ejikọta na imegharị mitochondria site na mmepụta ọhụrụ na autophagy. Autophagy bụ otu alaka n'ime ọtụtụ mmetụta ya, ọ bụghị akụkọ ahụ dum.
Ihe nnwale ndị ahụ anaghị egosi
Ịnapụ serum na-eṅomi nrụgide sitere na enweghị nkwado uto na mgbanwe kemịkalụ n'ime efere nnwale. Ọ naghị eṅomi ibu ọnụ nke ihe dị ndụ dum: glucose, amino acid, na nnu ka dị n'ime mmiri isi a na-azụ mkpụrụ ndụ, ọ dịghịkwa omume iri nri dị ebe ahụ. A pụghị ịtụgharị ịta kemịkalụ e ji azụ mkpụrụ ndụ, site na 20 nM ruo 5 μM, ka ọ bụrụ oke a ga-enye mmadụ site na mgbakọ, n'ihi na mmịkọ, njikọ na protein, ọnọdụ redox, mgbanwe kemịkalụ, nchịkọta n'anụ ahụ, na ogologo oge ihe ahụ nọ n'ime ahụ niile dị iche.
Ọ dịghị nnwale n'ime mmadụ e mere kpọmkwem iji gosi ngafe autophagy nke methylene blue kpalitere n'ime ndị ọrịa. Ihe akaebe gbasara usoro ọrụ ka sitere na ọrụ n'ime mkpụrụ ndụ, n'anụ ahụ ewepụtara n'ahụ ihe dị ndụ, na n'anụmanụ; nyocha nchịkọta ka na-akọwakwa ihe akaebe gbasara itinye ya n'ọrụ n'ime mmadụ dịka nke mbido. Ya mere, ọmụmụ ndị a anaghị egosi na methylene blue na-eṅomi ibu ọnụ, na-agbatị ndụ mmadụ site na autophagy, ma ọ bụ na-emecha ngafe autophagy n'ụbụrụ mmadụ. Nkwupụta gbasara iṅomi ibu ọnụ na ogologo ndụ chọrọ ihe akaebe nnwale ụlọọgwụ nke ha, nnwale methylene blue n'ime mmadụ maka ihe ndị ọzọ anaghị aghọ nnwale autophagy naanị n'ihi njikọ ha. A kwesịrị ịgụ nyocha gbasara ụdị nnwale nrụgide ihe nri na ogologo ndụ n'iburu oke a n'uche.
Maka akwụkwọ ọzọ ị ga-agụ, tinye ndepụta nyocha ahụ n'ọrụ n'usoro. Buru ụzọ jụọ alaka gbanwere: AMPK, mTOR, ma ọ bụ na ọ dịghị nke gbanwere. Jụzie ma e jikọtara nsonaazụ LC3 na ule ngafe ma ọ bụ na ọ kwụ naanị ya. Leleezie ma igbochi ụzọ ahụ wepụrụ uru ahụ, na usoro e ji mee ya. Ọmụmụ zara ajụjụ atọ ahụ enwetala ntọala maka nkwupụta siri ike gbasara usoro ọrụ. Nke zara naanị nke mbụ egosila mgbaàmà ikike, akụkụ ndị ọzọ nke njem ahụ ka bụ ihe a na-enyochabeghị.