Մեթիլենային կապույտը ինսուլտի և ուղեղային հիպոպերֆուզիայի հետազոտություններում․ ինչ են իրականում ցույց տալիս երեք մոդելները

Խցանված զարկերակը, սննդանյութերից զրկված բջջային կուլտուրան և պարանոցի նեղացած զարկերակներով առնետը կարող են թվալ միևնույն փորձի երեք տարբերակներ։ Բայց այդպես չէ։ Յուրաքանչյուրը տարբեր հարց է առաջադրում, և մեթիլենային կապույտը յուրաքանչյուրում տարբեր պատասխան է տալիս։ Եթե դրանք շփոթենք, գիտական գրականությունը հակասական կթվա։ Եթե տարանջատենք, հստակ օրինաչափություն կհայտնվի, որը հիմնականում պայմանավորված է կիրառման պահով։

Այս ամփոփման ամբողջ նպատակը հենց այդ տարանջատումն է։ Երեք մոդելներն են սուր օջախային ինսուլտը, մշակված բջիջներում թթվածնից ու գլյուկոզից զրկումը՝ թթվածնամատակարարման հետագա վերականգնմամբ, և շաբաթներ տևող քրոնիկ ուղեղային հիպոպերֆուզիան։ Դրանք կապող ենթադրվող մեխանիզմը միտոքոնդրիալ է, բայց արդյունքները տարբերվում են, քանի որ նյութափոխանակային պայմաններն են տարբերվում։

Երեք մոդելները տարբեր հարցերի են պատասխանում

Առնետների սուր օջախային ինսուլտը սովորաբար առաջացնում են միջին ուղեղային զարկերակի խցանմամբ, որը կրճատ անվանում են MCAO։ Թրոմբի նման խցանումը ստեղծում է իշեմիկ միջուկ՝ շրջապատված պենումբրայով, այսինքն՝ վտանգված, բայց արյունահոսքի վերականգնման դեպքում հնարավոր փրկելի հյուսվածքով։ Այստեղ հարցն այն է, թե արդյոք միջամտությունը դանդաղեցնում է ինֆարկտի մեծացումը կամ պահպանում գործառույթը ռեպերֆուզիայի շրջանում։

Թթվածնից ու գլյուկոզից զրկումը, կրճատ՝ OGD, կիրառվում է հակառակ մասշտաբով։ Մշակված ուղեղային բջիջները տեղադրվում են գրեթե զրոյական թթվածնով և առանց գլյուկոզի միջավայրում, ապա վերադարձվում բնականոն միջավայր։ Այստեղ չկան թրոմբ, կոլատերալ արյան շրջանառություն, արյան ճնշում կամ իմունային համակարգ։ Հարցը զուտ բջջային է․ ինչ է տեղի ունենում շնչառության, ATP-ի և գոյատևման հետ, երբ սուբստրատները վերանում են, ապա վերադառնում։

Քրոնիկ ուղեղային հիպոպերֆուզիայի դեպքում առնետների քնային զարկերակները մշտապես խցանում են երկու կողմից․ սա կոչվում է 2VO մոդել։ Առաջային ուղեղի արյունահոսքը նվազում է և շաբաթներով մնում ցածր։ Չկա հանկարծակի օջախային ինֆարկտ կամ շտապ ռեպերֆուզիա։ Հարցն այն է, թե արդյոք շաբաթներ տևող նյութափոխանակային աջակցությունը պահպանում է անոթները, միտոքոնդրիաները և հիշողությունը երկարատև ցածր արյունահոսքի պայմաններում։

Հետևաբար, 2VO մոդելում մեկ ամիս բուժումից հետո հիշողության բարելավումն ուղղակիորեն ոչինչ չի ասում շտապ թրոմբէկտոմիայի ժամանակ մարդու ուղեղը փրկելու մասին։ Այս տարբերակումը կարևոր է, քանի որ լավատեսական ամփոփումների մեծ մասն այն բաց է թողնում։

Սուր ինսուլտ․ պաշտպանություն ռեպերֆուզիայի ժամանակ, իսկ դրա բացակայության դեպքում՝ հետաձգում

Սուր վիճակում ամենահստակ արդյունքը ստացվել է ռեպերֆուզիայով անցողիկ MCAO մոդելում։ Առնետների զարկերակը խցանված է եղել 60 րոպե, ապա ռեպերֆուզիայի մեկնարկից նրանց ներերակային տրվել է մեթիլենային կապույտի ցածր դեղաչափ՝ լրացուցիչ դեղաչափերով 3 ժամ անց և 2-րդ օրը։ MRI-ն ցույց է տվել, որ կրիչ լուծույթ ստացած խմբում ախտահարման օջախը մինչև 2-րդ օրը մեծացել է մոտ 19 տոկոսով, մինչդեռ բուժում ստացած խմբում այն փոքրացել է մոտ 17 տոկոսով․ վերջնական ինֆարկտները մոտ 30 տոկոսով ավելի փոքր են եղել, իսկ նյարդաբանական գնահատականները՝ ավելի լավը 2-րդ և 7-րդ օրերին։ Պատկերային հետազոտությամբ բարելավվել է ինչպես միջուկի, այնպես էլ պենումբրայի հյուսվածքի պահպանվածությունը։ Նյարդապաշտպանության վերաբերյալ ավելի լայն գրականությունը ռեպերֆուզիայի պահին դիտված այս պաշտպանությունը ներկայացնում է համատարած իշեմիայի և վնասվածքների վերաբերյալ արդյունքների կողքին։

Պատկերը փոխվում է, երբ զարկերակը մնում է խցանված։ Մշտական MCAO փորձի ընթացքում շարունակվող իշեմիայի պայմաններում տրված մեթիլենային կապույտը դանդաղեցրել է դիֆուզիոն պատկերմամբ երևացող ախտահարման տարածումը և կարճ ժամանակով երկարաձգել պերֆուզիոն ու դիֆուզիոն փոփոխությունների անհամապատասխանությունը՝ տեղային արյունահոսքի փոքր բարելավմամբ, բայց 24 ժամ անց ինֆարկտի վերջնական ծավալը նշանակալիորեն չի տարբերվել։ Այն հետաձգել է վտանգված հյուսվածքի անցումը ինֆարկտի՝ առանց անոթի վերաբացմանը փոխարինելու։

Երրորդ սուր հետազոտությունն ավելացնում է մեխանիզմի և դեղաչափի վերաբերյալ նրբություններ։ Խցանումից անմիջապես հետո տրված մեկ ներորովայնային դեղաչափը ցույց է տվել ինֆարկտի ամենամեծ նվազումը՝ մոտ 50 տոկոս, միջանկյալ 5 mg/kg դեղաչափի դեպքում, այլ ոչ թե 1 կամ 10 mg/kg-ի, ինչպես նաև ավելի լավ զգայաշարժողական գնահատականներ։ Հեղինակները դա կապել են միտոքոնդրիալ կառուցվածքի պահպանման և միտոֆագիայի՝ վնասված միտոքոնդրիաների ընտրողական հեռացման ուժեղացման հետ։ Ուստի դեղաչափը, ներմուծման ուղին և ժամանակացույցը կարևոր են, իսկ առնետների mg/kg արժեքները մարդու ինսուլտի բուժման դեղաչափեր չեն։

Բջջային կուլտուրա․ նույն դեղը օգնում կամ վնասում է՝ կախված կիրառման պահից

Աստրոցիտների փորձն ամենաուսանելի և ամենից հաճախ սխալ մեջբերվողն է։ Մկների ուղեղի կեղևի առաջնային աստրոցիտները 6 ժամ ենթարկվել են խիստ զրկման՝ 0.1 տոկոս թթվածնով միջավայրում, առանց գլյուկոզի, պիրուվատի կամ շիճուկի, ինչին հաջորդել է թթվածնամատակարարման 24-ժամյա վերականգնում՝ սուբստրատների վերադարձով։ Բջիջների մոտ կեսը մահացել է, ինչը փորձին հնարավորություն է տալիս ցույց տալ ազդեցություն երկու ուղղությամբ էլ։

Երբ մեթիլենային կապույտը առկա է եղել զրկման փուլում, գոյատևումը վատացել է, ոչ թե բարելավվել։ Իսկ երբ այն ներմուծվել է թթվածնամատակարարման վերականգնման պահին, ցածր միկրոմոլային կոնցենտրացիաները բարելավել են կենսունակությունը և բարձրացրել թթվածնի սպառումը, գլյուկոզի կլանումը և ATP-ի արտադրությունը։ Բնականոն պայմաններում նույն կոնցենտրացիաները մեծացրել են գլյուկոզի կլանումը մոտ 89 տոկոսով՝ 0.1 միկրոմոլայինի, և մոտ 200 տոկոսով՝ 1 միկրոմոլայինի դեպքում․ վնասումից հետո պահպանվել են գլիկոգենը և հեքսոկինազի ակտիվությունը, իսկ սուպերօքսիդի չափելի աճ չի գրանցվել։

Մեխանիզմն ավելի հեշտ է հասկանալ պահուստային գեներատորի համեմատությամբ։ Մեթիլենային կապույտը գործում է որպես էլեկտրոնների այլընտրանքային փոխադրիչ, որն ընդունում է վերականգնող համարժեքները և դրանք փոխանցում դեպի ցիտոքրոմ c և IV համալիր՝ աջակցելով էլեկտրոնների հոսքին և ATP-ի սինթեզին ու միաժամանակ նվազեցնելով շղթայի նախորդ հատվածներից էլեկտրոնների արտահոսքը։ Խիստ զրկման ընթացքում այդ խթանումը վնասակար է, քանի որ բարձրացնում է նյութափոխանակային պահանջը, երբ թթվածինն ու գլյուկոզը գրեթե բացակայում են, և կարող է ավելի արագ սպառել վերջին պաշարները։ Սուբստրատների վերադարձից հետո նույն հատկությունն առավելություն է դառնում, քանի որ օգնում է վնասված միտոքոնդրիաներին արդյունավետ օգտագործել վերականգնված թթվածինն ու գլյուկոզը։ Այդ պատճառով էլ միտոքոնդրիալ էլեկտրոնափոխանակության մասին բացատրություններում ներկայացվող արդյունքները պետք է դիտարկել զրկման պայմանների համատեքստում։

Մի վերապահում․ կիրառման պահի այս օրինաչափությունը վերաբերում է աստրոցիտների հենց այդ պատրաստուկին։ Ուղեկցող բջջային հետազոտությունը, որն օգտագործել է այլ տեսակի բջիջներ, ավելի մեղմ զրկում և ավելի ցածր կոնցենտրացիա, պաշտպանություն է հայտնաբերել նույնիսկ զրկման ընթացքում կիրառման դեպքում։ Բջջի տեսակը, մնացորդային թթվածինը, կոնցենտրացիան և փորձակարգը որոշում են ազդեցության ուղղությունը։

Քրոնիկ ցածր արյունահոսք․ հիշողություն, ցիտոքրոմօքսիդազ և անոթներ՝ շաբաթների ընթացքում

Քրոնիկ փորձերում օգտագործվել է շաբաթներ տևող ամենօրյա բուժում ցածր դեղաչափով, ոչ թե մեկ շտապ բոլյուսային ներմուծում։ Առաջին հետազոտությունում քնային զարկերակների մշտական խցանումով առնետները մեկ ամսվա ընթացքում օրական ստացել են 4 mg/kg՝ յուրաքանչյուր օրվա ուսուցման պարապմունքից հետո, որպեսզի ազդեցությունն ուղղվի հիշողության ամրապնդմանը, ոչ թե անմիջական առաջադրանքի կատարմանը։ Խցանումով կենդանիներն ավելի դանդաղ են յուրացրել տեսողական տարբերակման առաջադրանքները և ավելի վատ արդյունքներ ցույց տվել հիշողության բարդ ստուգման ժամանակ, մինչդեռ լողալու կարողությունը, շարժողական ակտիվությունը և հոտերի ճանաչումը չեն փոխվել։ Ամենօրյա բուժումը մեղմացրել է ուսուցման և հիշողության խանգարումները՝ առանց ընդհանուր շարժողական վարքը փոխելու։

Հետագա հետազոտությունում նույն մեկամսյա սխեմայից հետո ուղեղի 44 հատվածներում քարտեզագրվել է ցիտոքրոմօքսիդազը, որը միտոքոնդրիալ IV համալիրն է։ Խցանումը նվազեցրել է ֆերմենտի ակտիվությունը տեսողական, նախաճակատային և պերիռինալ կեղևում, ինչպես նաև հիպոկամպում ու նշաձև մարմնում, և թուլացրել տեսողական կեղևի ու հիպոկամպի համաձայնեցված ակտիվությունը։ Բուժումը պահպանել է ֆերմենտի տեղային ակտիվությունը և ուժեղացրել այդ միջտարածքային նյութափոխանակային համահարաբերակցությունները, իսկ պահպանված ակտիվությունը համահարաբերակցվել է առաջադրանքների ավելի լավ կատարման հետ։ Այս համահարաբերակցությունները նկարագրում են նյութափոխանակային ֆերմենտի համաձայնեցված ակտիվությունը, ոչ թե մարդու ուղեղի գործառական կապակցվածության ուղղակի չափումները․ այս տարբերակումը հստակ պահելուն օգնում են ուղեղի էներգետիկ նյութափոխանակության ամփոփումները։

Մեկ այլ՝ մեկշաբաթյա հետազոտությունում օրական օգտագործվել է 2 mg/kg և մեխանիզմը ստուգելու համար ավելացվել ազդանշանային ուղու արգելակիչ։ Բուժման ընթացքում ուղեղային արյունահոսքը մոտ 60-ից աճել է մինչև մոտ 100 mL՝ 100 g-ի հաշվով մեկ րոպեում, իսկ հիպոկամպի անոթային խտությունը՝ մոտ 15.1-ից մինչև 23 տոկոս։ Երկու բարելավումներն էլ մասամբ հետ են շրջվել, երբ արգելափակվել է բջջային գոյատևման PI3K/Akt ուղին, իսկ բուժման ընթացքում ֆոսֆորիլացված Akt-ն ավելացել է։ Արյունահոսքի, անոթային խտության, պատնեշի և նեյրոնների վերաբերյալ արդյունքները մատնանշում են PI3K/Akt ազդանշանավորման հետ կապված նյարդաանոթային պաշտպանություն, այլ ոչ թե զուտ նյութափոխանակային ազդեցություն։

Ինչու այս ամենը համարժեք չէ ինսուլտի շտապ բուժօգնությանը

Լաբորատոր վերահսկվող պայմաններն են պատճառը, որ այս արդյունքները հնարավոր չէ ուղղակիորեն տեղափոխել կլինիկական միջավայր։ Մշակված բջիջներում չկան թրոմբ կամ դեղակինետիկ գործընթացներ։ 2VO մոդելը երկարատև համատարած ցածր արյունահոսք է, ոչ թե հանկարծակի օջախային էմբոլ՝ ընդամենը մի քանի րոպե առաջ ձևավորված պենումբրայով։ Նույնիսկ առնետների MCAO մոդելում օգտագործվում են երիտասարդ առողջ կենդանիներ, անզգայացում, միատեսակ խցանումներ և ճշգրիտ ժամանակավորված դեղաչափեր՝ ի տարբերություն տարեց հիվանդների, որոնք ունեն տարբեր թրոմբեր, աթերոսկլերոզ, հիպերտոնիա, շաքարային դիաբետ և հիվանդության սկզբի անհայտ ժամանակ։

Մարդկանց մասնակցությամբ որևէ հրապարակված պատահականացված փորձարկում չի հաստատել մեթիլենային կապույտը որպես սուր իշեմիկ ինսուլտի շտապ բուժման միջոց։ Երբեմն մեջբերվող՝ մարդկանց մասնակցությամբ պատկերային հետազոտությունում ընդգրկվել են 26 առողջ չափահասներ, ոչ թե ինսուլտով հիվանդներ, և մեկ բերանային դեղաչափը փոխել է առաջադրանքների հետ կապված ուղեղային ազդանշանները՝ հիշողությունից տեղեկության վերարտադրման փոքր բարելավմամբ։ Սա ցույց է տալիս կենտրոնական նյարդային համակարգի վրա ազդեցություն, ոչ թե արդյունավետություն ինսուլտի դեպքում։ Շտապ բուժօգնության ներկայիս ուղեցույցները փոխարենը կենտրոնանում են արագ ռեպերֆուզիայի վրա՝ համապատասխան հիվանդների ներերակային թրոմբոլիզով և խոշոր անոթների համապատասխան խցանումների դեպքում թրոմբէկտոմիայով, իսկ ինսուլտի շտապ բուժօգնության ստանդարտ ուղիները մնում են միակ ապացուցված տարբերակը։ Ինսուլտի կասկածի դեպքում բուժօգնությունը երբեք չպետք է հետաձգվի մեթիլենային կապույտ տալու համար, իսկ նախակլինիկական դեղաչափերի արտարկման գործնական սահմանափակումները բացատրում են, թե ինչու առնետների կիրառման ժամանակացույցերը չի կարելի դիտարկել որպես կլինիկական սխեմաներ։

Անվտանգության համատեքստն ընդգծում է այս սահմանը։ Ներերակային մեթիլենային կապույտի համար առկա է շրջանակված նախազգուշացում ծանր կամ մահացու սերոտոնինային համախտանիշի մասին, երբ այն համակցվում է սերոտոնիներգիկ դեղերի, այդ թվում՝ SSRI-ների, SNRI-ների և MAO արգելակիչների հետ, որոնք ընդունում են ինսուլտին բնորոշ տարիքային խմբի բազմաթիվ հիվանդներ։ Այն հակացուցված է G6PD-ի անբավարարության դեպքում՝ հեմոլիզի վտանգի պատճառով։ Այն նաև արգելակում է ազոտի օքսիդի ազդանշանավորումը, ինչը որոշ պայմաններում բարձրացնում է անոթային դիմադրությունը և ճնշումը, ուստի այն չպետք է պարզապես նկարագրել որպես ուղեղի արյունահոսքն ավելացնող դեղ։ Ձեռքբերովի մեթհեմոգլոբինեմիայի համար հաստատված 1 mg/kg ներերակային սխեման ինսուլտի բուժման սխեմա չէ։

Անկեղծ ամփոփումը սահմանափակ է, բայց հիմնավորված։ Անցողիկ օջախային իշեմիայի դեպքում ռեպերֆուզիայի շրջանում մեթիլենային կապույտի ցածր դեղաչափը նվազեցրել է առնետների ախտահարման զարգացումը։ Մշտական խցանման պայմաններում այն հետաձգել է ինֆարկտը, բայց չի կանխել այն։ Աստրոցիտներում այն վնասել է խիստ զրկման ընթացքում և օգնել թթվածնամատակարարման վերականգնման ժամանակ։ Քրոնիկ հիպոպերֆուզիայի ընթացքում այն շաբաթներով պահպանել է ցիտոքրոմօքսիդազը, անոթները և հիշողությունը։ Մեկ փոխադրիչ, երեք համատեքստ, երեք պատասխան։