Մեթիլենային կապույտի կլանման սպեկտրը և մոլային կլանման գործակիցը․ պայմանների նշումով տեղեկատու

Մեթիլենային կապույտի սպեկտրը պարզ է թվում, մինչև փորձում եք դրանից վերցված որևէ թիվ կրկին օգտագործել։ Մի լաբորատորիա հայտնում է մոտ 82,000 մոլային էքստինկցիայի գործակից։ Մյուսը հայտնում է 67,000։ Երրորդը հայտնում է ավելի քան 100,000։ Երեքն էլ կարող են ճիշտ նկարագրել իրենց չափումները, բայց դրանցից ոչ մեկը ներկանյութի համընդհանուր հաստատունը չէ։

Շփոթությունն առաջանում է երկու տարբեր հասկացություններ խառնելուց։ Օպտիկական խտությունը որոշակի լուծույթի՝ որոշակի կյուվետում կատարված չափման արդյունք է։ Մոլային կլանման գործակիցը, որը հաճախ նշվում է էպսիլոնով, այդ լուծույթը նկարագրող մոդելի պարամետր է։ Երբ փոխվում է մեթիլենային կապույտի մոլեկուլների միավորման վիճակը, փոխվում է մոդելը, հետևաբար նաև պարամետրը։ Օգտակար սովորություն է յուրաքանչյուր գործակից դիտարկել որպես պայմաններով պիտակավորված արժեք․ թվի հետ պետք է նշվեն ալիքի երկարությունը, լուծիչը, pH-ը կամ բուֆերը, ջերմաստիճանը, կոնցենտրացիայի միջակայքը և օպտիկական ուղու երկարությունը։

Մոնոմերի շերտը ջրում նոսր լուծույթի դեպքում

Նոսր ջրային լուծույթում մեթիլենային կապույտի կատիոնի գերակշռող շերտը գտնվում է մոտ 664-ից 665 nm տիրույթում։ Տարբեր սարքերի և տրամաչափարկման ընտրությունների դեպքում սովորաբար նշվում է 664-ից 668 nm միջակայքը։ Այդ շերտը հարմար ընտրություն է քանակական որոշման համար, երբ լուծույթն այնքան նոսր է, որ ներկանյութի մեծ մասը մոնոմերային վիճակում է։

Գրականության երեք արժեք ցույց են տալիս, թե ինչու են պայմաններն ավելի կարևոր, քան հիմնական թիվը։ Կավի հետազոտողները, որոնք ջրային նմուշների կոնցենտրացիան պահել են մոտ 7 micromolar-ից ցածր՝ 1 cm կյուվետներում, 665 nm-ի դեպքում հայտնել են մոտ 82,000 M-1 cm-1 էպսիլոն։ Այս արժեքը բացառիկ լավ է փաստագրված որպես շատ նոսր ջրային նմուշների փորձարարական տրամաչափարկման թեքություն։ Ավելի ուշ կատարված առաջնային տրամաչափարկումը դեիոնացված ջրում, 2.34-ից 37.52 micromolar միջակայքում և 1 cm օպտիկական ուղու դեպքում, ամբողջ ներկանյութի համար 665 nm-ում տվել է մոտ 67,100 M-1 cm-1։ Ավելի ցածր արդյունքը սպասելի է և հակասություն չէ, քանի որ տրամաչափարկման այդ միջակայքի վերին կեսում արդեն զգալի քանակությամբ դիմեր կա։ Երրորդ արժեքը՝ մոտ 73,460 M-1 cm-1՝ 664 nm-ում, ստացվել է pH 6.86 և 293 K պայմաններում կատարված աշխատանքից, որտեղ դիտված սպեկտրը տարրալուծվել է մոնոմերային և դիմերային մասերի։ Այդ աշխատանքն ամփոփված է մեթիլենային կապույտի ֆոտոֆիզիկայի վերջին քննադատական ակնարկում։ Այդ թիվը ապակոնվոլյուցիայով առանձնացված մոնոմերային բաղադրիչ է, ոչ թե ամբողջ ներկանյութի կոնցենտրացիայի նկատմամբ օպտիկական խտության ուղղակի թեքություն։

Գործնական հետևությունը սա է․ ընտրեք ձեր նմուշների պայմաններին համապատասխանող գործակիցը կամ կատարեք ձեր սեփական տրամաչափարկումը։ Մի կիրառեք 82,000 արժեքը 30 micromolar կոնցենտրացիայով ֆոսֆատային բուֆերում կատարվող որոշման համար՝ ենթադրելով, որ գծայնությունը դեռ պահպանվում է։

Կարճալիքային ուսը բաղադրիչների խառնուրդ է

Կոնցենտրացիայի բարձրացման հետ մոտ 600-ից 615 nm տիրույթում գտնվող ուսն աճում է 664 nm գագաթի նկատմամբ։ Ժամանակակից աշխատանքներում H տիպի դիմերի ներդրումը սովորաբար տեղադրվում է մոտ 605-ից 610 nm տիրույթում։ Ջրում մեթիլենային կապույտի համընդհանուր սպեկտրային վերլուծությունը առանձնացնում է դիմերի առավելագույնը 607 nm-ում և ավելի բարձր կարգի ագրեգատի առավելագույնը՝ 600 nm-ում, իսկ մոնոմերի ռեզոնանսային բաղադրիչները՝ 664 և 650 nm-ում։ Ամբողջական տեքստը հասանելի է PMID 33251415-ի բաց հասանելիության գրառման միջոցով։

Այդ ուսը չպետք է բնութագրել որպես միայն դիմերի օպտիկական խտություն։ Նույն տիրույթում ներդրում ունի նաև մոնոմերի վիբրոնային կառուցվածքը, ուստի չափված բարձրությունը բաղադրիչների վերադրման արդյունք է։ Մեկ համընդհանուր համապատասխանեցում ցույց է տվել, որ մոնոմեր և դիմեր ներառող մոդելը չի նկարագրում ամբողջ 1.1 micromolar-ից 3.4 millimolar միջակայքը, մինչդեռ տետրամերի ավելացումը տվել է լավագույն համապատասխանությունը։ Ընդ որում, տետրամերի ազդանշանն արդեն հայտնաբերվել է 34 micromolar-ից ցածր կոնցենտրացիաներում։ Համապատասխանեցմամբ ստացված բաղադրիչների գործակիցները մեծ էին՝ մոտ 107,800 M-1 cm-1՝ հիմնական մոնոմերային բաղադրիչի համար 664 nm-ում, մոտ 101,400՝ դիմերի համար 607 nm-ում և մոտ 138,500՝ տետրամերի համար 600 nm-ում։ Պայմաններն էին առանց բուֆերի դեիոնացված ջուր, նատրիումի քլորիդի կոնցենտրացիա՝ 0-ից 0.15 M, և ջերմաստիճան՝ 282-ից 333 K։ Դրանք մոդելով առանձնացված բաղադրիչներ են, ուստի չպետք է օգտագործվեն փորձարարական Բերի–Լամբերտի թեքության փոխարեն։

Դիմերացման ուժգնությունը քանակապես գնահատվել է ուղղակիորեն։ pH 6.86 և 293 K պայմաններում մեկ ուսումնասիրություն ստացել է մոտ 3,900 M-1 դիմերացման հաստատուն։ Այդ մեծությունը բացատրում է, թե ինչու է 5 micromolar աշխատանքային լուծույթը գրեթե գծային վարք ցուցաբերում, իսկ 50 micromolar մայր լուծույթը՝ ոչ։ Մեթոդի մշակման ընթացքում օգտակար ստուգում է մոտ 610 nm-ում օպտիկական խտության հարաբերությունը մոտ 665 nm-ում օպտիկական խտությանը։ Երբ այդ հարաբերությունն աճում է կոնցենտրացիայի հետ, 664 nm-ում էպսիլոնն այլևս չի նկարագրում մեկ անփոփոխ քիմիական տեսակ։

Կոնցենտրացիայի այն միջակայքում, որտեղ գերակշռում է միմյանց փոխակերպվող տեսակների մեկ զույգ, սպեկտրները կարող են ունենալ ընդհանուր իզոսբեստիկ կետ, որը ջրային լուծույթների շարքերում փորձնականորեն գտնվում է մոտ 625 nm-ում։ Հստակ անշարժ կետը համահունչ է երկու գերակշռող տեսակների առկայությանը։ Երբ կոնցենտրացիայի բարձրացման հետ այդ կետը տեղաշարժվում կամ անհետանում է, դա դիտարկեք որպես ավելի բարձր կարգի ագրեգատների կամ փոփոխվող հավասարակշռությունների առաջացման նախազգուշացում, ոչ թե սարքի սխալ։

Լուծիչը, pH-ը և ջերմաստիճանը տեղաշարժում են սպեկտրը

Ջուրը նպաստում է մոլեկուլների միավորմանը։ Դիմեթիլսուլֆօքսիդի ավելացումը ճնշում է դիմերացումը, կլանման և ֆլուորեսցենցիայի առավելագույնները տեղաշարժում է դեպի ավելի երկար ալիքներ և ֆլուորեսցենցիայի քվանտային ելքը մեծացնում մոտ չորս անգամ՝ ըստ ջրի և DMSO-ի խառնուրդներում մեթիլենային կապույտի լուծիչային ուսումնասիրության, որը ինդեքսավորված է որպես PMID 30933781։ Այդ աշխատանքում ջրային սպեկտրները դիտարկվում են որպես մոնոմեր–դիմեր հավասարակշռություն՝ մոնոմերի կլանումը մոտ 650-ից 670 nm, իսկ դիմերինը՝ մոտ 580-ից 615 nm տիրույթում։ Դիմերացման հաստատունները ստացվում են 293.15 K-ում գրանցված սպեկտրներից։

Սպիրտները փոխում են ինչպես դիրքը, այնպես էլ թվացյալ ուժգնությունը, բայց չեն վերացնում ագրեգացումը։ 31.3 micromolar կոնցենտրացիայի և սենյակային ջերմաստիճանի պայմաններում կատարված մեկ առաջնային համեմատության մեջ, որը ներկայացված է մեթիլենային կապույտի լուծիչային ուսումնասիրությունում, երկարալիքային առավելագույնը ջրում եղել է 665 nm, իսկ մեթանոլում՝ 655 nm։ Ամբողջ լուծույթի համար թվացյալ արժեքները կազմել են մոտ 37,100՝ ջրում և 60,800՝ մեթանոլում։ Բացարձակ էթանոլում 298 K-ում կատարված առանձին վավերացման արդյունքում առավելագույնը եղել է 655 nm-ում, իսկ էպսիլոնը՝ մոտ 68,000։

pH-ի սովորական փոփոխությունները սպեկտրը տեղաշարժում են ավելի քիչ, քան ենթադրվում է շատ մեթոդակարգերում։ Վերը վկայակոչված քննադատական ակնարկը հայտնում է, որ մոտ pH 2-ից մինչև pH 12 առավելագույնը մնացել է 665 nm-ի մոտ, իսկ մինչև pH 11 ուժգնության փոփոխությունները փոքր են եղել։ Բուֆերի տեսակը և իոնային ուժը կարող են արդյունքները փոխել նույնքան, որքան անվանական pH-ը, ուստի գրանցեք օգտագործված բուֆերն ու աղը, ոչ միայն pH-մետրի ցուցմունքը։ Ուժեղ թթուն կամ ուժեղ ալկալին առանձին դեպք է, քանի որ ներկանյութը կարող է ենթարկվել քիմիական փոփոխության՝ շրջելի միավորման փոխարեն։ Ջերմաստիճանն ու աղը նույնպես տեղաշարժում են հավասարակշռությունը, այդ պատճառով ջրում կատարված 2020 թվականի ուսումնասիրությունում երկուսն էլ միտումնավոր փոփոխվել են։

Ինչպես չափել, որ թիվը մնա վավեր

Քանակական աշխատանքը հիմնվում է Բերի–Լամբերտի առնչության վրա․ օպտիկական խտությունը հավասար է էպսիլոնի, կոնցենտրացիայի և օպտիկական ուղու երկարության արտադրյալին։ Բացի այդ, անհրաժեշտ է ապացուցել, որ գծային միջակայքն իսկապես պահպանվում է ձեր պայմաններում։

Ցածր micromolar կոնցենտրացիաների դեպքում օգտագործեք 1 cm կյուվետ։ Մոտ 82,000 էպսիլոնի դեպքում 5 micromolar-ը տալիս է մոտ 0.41 օպտիկական խտություն, իսկ 10 micromolar-ը՝ մոտ 0.82։ Սովորական ջրում մոնոմերի չափման վրա կենտրոնանալու դեպքում մոտ 5-ից 7 micromolar սահմաններում կամ դրանցից ցածր մնալն ավելի ապահով է, քան տրամաչափարկումը տասնյակ micromolar կոնցենտրացիաներ ընդգրկող տիրույթում կատարելը։ Խիտ մայր լուծույթների համար կրճատեք օպտիկական ուղին՝ 1-ից շատ բարձր օպտիկական խտություն ընդունելու փոխարեն։

Զրոյացման համար օգտագործեք նույնական մատրից՝ նույն որակի ջուր, օժանդակ լուծիչի նույն բաժինը, նույն բուֆերն ու աղերը, բայց առանց ներկանյութի։ Տրամաչափարկման լուծույթները պատրաստեք այդ նույն մատրիցում և նույն ջերմաստիճանում։ Մշակման ընթացքում սկանավորեք ամբողջ տեսանելի տիրույթը, ցանկալի է՝ մոտ 550-ից 750 nm, ոչ թե չափեք միայն մեկ ալիքի երկարության վրա։ Հետևեք ձևին, ոչ միայն բարձրությանը։ Եթե հաջորդական նոսրացումը փոխում է նորմավորված ձևը, համակարգը քիմիապես կախված է կոնցենտրացիայից։ Կայուն առավելագույնը և 610 ու 665 nm-ում օպտիկական խտությունների կայուն հարաբերությունն ընդունելի միջակայքի ավելի համոզիչ ապացույցներ են, քան միայն R-ի քառակուսու բարձր արժեքը։

Փաստագրեք ռեագենտի ձևը։ Առևտրային նյութը կարող է լինել անջուր մեթիլթիոնինի քլորիդ կամ հիդրատ, օրինակ՝ տրիհիդրատ, ուստի մայր լուծույթի հաշվարկներում օգտագործվող մոլային զանգվածը պետք է համապատասխանի շշի իրական պարունակությանը։ Միայն այս քայլը բացատրում է տարբեր լաբորատորիաների անվանական մոլային կոնցենտրացիաների անհամապատասխանության մի մասը։ Նույնպիսի ճշգրտություն է անհրաժեշտ, երբ արդյունքներն օգտագործվում են քանակական որոշման հաշվարկներում, երբ սպեկտրները հիմք են բաղադրության կայունության ստուգումների համար, և երբ խառնուրդների պրոֆիլները պահանջում են մաքրության ու սպեցիֆիկացիայի վերանայում։

Ամփոփում՝ պայմանների նշումով

Այս աղյուսակն օգտագործեք որպես լաբորատոր գրառման նախնական ձևանմուշ, ոչ թե որպես փոխարինելի հաստատունների աղբյուր։

Այսպիսով, մեթիլենային կապույտի կլանման ալիքի երկարության հարցն ունի կարճ պատասխան՝ երկար ծանոթագրությամբ։ Հաղորդեք ձեր չափած գագաթը՝ ձեր չափած լուծույթում և ձեր չափած կոնցենտրացիայում։ Այդ սովորությունը թույլ չի տալիս, որ նոսր ջրային լուծույթի համար մոտ 664 nm-ում ստացված մեկ արժեք վերածվի կեղծ համընդհանուր հաստատունի։