Մեթիլենային կապույտը և Bartonella-ն․ լաբորատոր արդյունքները և կլինիկական ապացույցների սահմանափակումները

Կուլտուրայի թասի և հիվանդի դեպքում օգտագործվում է նույն բառը՝ վարակ, բայց ոչ նույն հասկացությունը։ Թասում վարակը ագարի վրա գաղութների քանակն է։ Հիվանդի դեպքում այն բջիջների և անոթների ներսում գտնվող բակտերիաներն են, արյան ու հյուսվածքների միջով անցնող դեղերը և աշխատանքի մի մասը կատարող իմունային համակարգը։ Եթե այս երկուսը շփոթենք, լաբորատոր տպավորիչ թիվը կսկսի բուժման նման թվալ։ Եթե դրանք տարանջատենք, նույն թիվը կդառնա այն, ինչ իրականում է՝ հաջորդ փորձը կատարելու հիմք։

Այդ տարանջատումն է մեթիլենային կապույտի և Bartonella-ի մասին այս ակնարկի ամբողջ նպատակը։ Մեկ հետազոտական խմբի երկու լաբորատոր ուսումնասիրություններում մեթիլենային կապույտը փորձարկվել է չաճող վիճակներում գտնվող Bartonella henselae-ի դեմ։ Երկուսն էլ արձանագրել են ուժեղ ակտիվություն ապակյա և պլաստիկ տարաներում։ Ոչ մեկում այն մարդկանց վրա չի փորձարկվել։

Ինչու են հետազոտողները փորձարկում ստացիոնար փուլը

Հակաբիոտիկների փորձարկումների մեծ մասում օգտագործվում են աճող բջիջներ։ Այդ մոդելը բաց է թողնում ավելի բարդ դեպքը՝ բջիջները, որոնք դադարել են բաժանվել և դիմանում են իրենց աճող նմանակներին ոչնչացնող դեղերին։

Bartonella-ն կարող է պահպանվել օրգանիզմում, այդ թվում՝ էրիթրոցիտների և էնդոթելային բջիջների ներսում։ Ուստի խումբը փորձել է պարզել, թե հաստատված որ դեղերը կարող են ոչնչացնել B. henselae-ն ստացիոնար փուլ մտնելուց հետո։ Աճող բջիջների նկատմամբ ցածր նվազագույն արգելակող կոնցենտրացիան՝ MIC-ը, չէր կանխատեսում ստացիոնար փուլում բջիջների ոչնչացումը։ Ռիֆամպինն ուներ շատ ցածր MIC, սակայն վատ էր ոչնչացնում ստացիոնար բջիջները, մինչդեռ ավելի բարձր MIC ունեցող միացությունները դրանք լավ էին ոչնչացնում։ Նման հոդվածները կարդալու ընդհանուր մեթոդ փնտրող ընթերցողները այն կգտնեն մեթիլենային կապույտի հետազոտությունները կարդալու ուղեցույցում։

Առաջին զննումը․ Լի և համահեղինակներ, 2019

Antibiotics-ում հրապարակված՝ ստացիոնար փուլի 2019 թվականի զննման ընթացքում օգտագործվել է մեկ շտամ՝ B. henselae JK53, որն աճեցվել է Schneider միջավայրում՝ 10 տոկոս պտղային տավարի շիճուկով, 37 C ջերմաստիճանում և 5 տոկոս CO2-ի պայմաններում։ Մեկօրյա կուլտուրաները հիմնականում պարունակում էին ցրված, բաժանվող բջիջներ։ Հնգօրյա կուլտուրաները, որոնց խտությունը մոտ 10-ի 8-րդ աստիճանի գաղութ առաջացնող միավոր էր մեկ mL-ում, համարվել են ստացիոնար փուլի կուլտուրաներ և պարունակել են տեսանելի կուտակումներ։

Թեստում կիրառվել է SYBR Green I-ը՝ պրոպիդիումի յոդիդի հետ, իսկ չափաբերումը կատարվել է կենդանի և իզոպրոպանոլով ոչնչացված բջիջների խառնուրդների միջոցով։ Քանի որ մեթիլենային կապույտը վառ գունավորում ունի, ակտիվություն ցուցաբերած նյութերի արդյունքները հաստատվել են մանրադիտակով, ապա՝ արյունային ագարի վրա գաղութների հաշվարկով, որն ավելի խիստ վերջնակետ է։

50 միկրոմոլային կոնցենտրացիայով փորձարկված 1,581 հաստատված դեղերից մեթիլենային կապույտի դեպքում կենսունակությունը կազմել է 16 տոկոս՝ միկրոթիթեղների ընթերցիչով, և 25 տոկոս՝ մանրադիտակով։ Դապտոմիցինի ցուցանիշը եղել է 21 տոկոս, մի քանի ազոլներինը՝ 22-ից 27 տոկոս, գենտամիցինինը՝ 32 տոկոս, էրիթրոմիցինինը՝ 66 տոկոս, ցիպրոֆլոքսացինինը՝ 74 տոկոս։ Պիրվինիումի պամոատն ընթերցիչով ավելի ուժեղ արդյունք է ցույց տվել, սակայն իր սեփական ֆլուորեսցենցիայի պատճառով այն հնարավոր չի եղել գնահատել մանրադիտակով։

Աճող B. henselae-ի նկատմամբ մեթիլենային կապույտի MIC-ը եղել է 0.08-ից 0.16 միկրոգրամ մեկ mL-ում։ Հնգօրյա ստացիոնար բջիջների դեպքում, մեկ mL-ում 5 միկրոգրամ կոնցենտրացիայի ազդեցությունից մեկ օր անց, գաղութներ այլևս չեն հայտնաբերվել․ արդյունքը համընկել է դապտոմիցինի և պիրվինիումի պամոատի՝ իրենց փորձարկված կոնցենտրացիաներում ստացված արդյունքին։ Ոչնչացման ժամանակային ընթացքի առանձին փորձարկման մեջ կիրառվել է մեկ mL-ում 10 միկրոգրամ։ Սրանք լաբորատոր ազդեցության մակարդակներ են, ոչ թե դեղաչափեր, և հոդվածում ներկայացված են հենց այդպես։ Հոդվածում մարդու պլազմայում մոտ 3.9 միկրոգրամ մեկ mL-ում առավելագույն կոնցենտրացիայի մեջբերված արժեքը նշվում է միայն որպես ընդհանուր համատեքստ։ Մեթիլենային կապույտի ֆարմակոկինետիկայի ակնարկը բացատրում է, թե ինչու պլազմային ցուցանիշը չի կարելի ընկալել որպես հյուսվածքային ցուցանիշ։

Հոդվածում հստակ նշված են երկու սահմանափակում։ Չի կիրառվել կենսաթաղանթի մոդել, և մեթիլենային կապույտի համակցություններ չեն փորձարկվել։ Հնգօրյա կուտակումները ստացիոնար հեղուկ կուլտուրայում բջջախմբեր էին, ոչ թե կենսաթաղանթի վավերացված փորձ։ Հեղինակները կոչ են արել կատարել կենդանիների, համակցությունների և կենսաթաղանթների ուսումնասիրություններ, ինչպես նաև փորձարկումներ Bartonella-ի այլ տեսակների վրա։

Համակցություններ և կենսաթաղանթից ստացված բջիջներ․ Չժեն և համահեղինակներ, 2020

BMC Microbiology-ում հրապարակված 2020 թվականի շարունակական ուսումնասիրությունը պահպանել է նույն շտամն ու միջավայրը, բայց անցել է վեցօրյա ստացիոնար կուլտուրաների և ավելացրել առաջին հոդվածում բացակայող երկու բաղադրիչ՝ երկու դեղից բաղկացած համակցություններ և կենսաթաղանթից ստացված բջիջների մոդել։

Առանձին դեղերը 24 ժամ շարունակ մեկ mL-ում միատեսակ 5 միկրոգրամ կոնցենտրացիայով փորձարկելիս մեթիլենային կապույտի դեպքում մնացել է 3.2 անգամ 10-ի 4-րդ աստիճանի գաղութ առաջացնող միավոր մեկ mL-ում՝ ստուգիչ նմուշի մոտ 2.8 անգամ 10-ի 10-րդ աստիճանի դիմաց։ Ցիպրոֆլոքսացինի, գենտամիցինի և նիտրոֆուրանտոինի դեպքում նույն պահին ավելի քիչ գաղութներ են մնացել։ Սա տարբերվում է 2019 թվականի արդյունքից, երբ նույն անվանական մակարդակի դեպքում մեկ օր անց հայտնաբերելի գաղութներ չեն եղել։ Կուլտուրայի տարիքը, խտությունն ու մշակման եղանակը տարբեր էին, ուստի ոչնչացման ազդեցությունը կրկնելի էր իր ուղղությամբ, բայց ոչ նույնական՝ իր մեծությամբ։ Փորձարկումից փորձարկում այս փոփոխությունն այն պատճառներից է, թե ինչու անվտանգության և փոխազդեցությունների ստանդարտ ստուգումներում լաբորատոր ակտիվությունը դիտարկվում է կլինիկական ազդեցությունից առանձին։

Համակցությունների զննումն ամենաշատ մեջբերվող մասն է։ Յուրաքանչյուր բաղադրիչի կոնցենտրացիան հաստատուն էր՝ մեկ mL-ում 5 միկրոգրամ։ Թե՛ ազիթրոմիցինի ու մեթիլենային կապույտի, թե՛ ռիֆամպինի ու մեթիլենային կապույտի համակցությունների դեպքում 24 ժամ անց ստացիոնար փուլի հայտնաբերելի գաղութներ չեն եղել։ Նույնը դիտվել է ցիպրոֆլոքսացին պարունակող երկու զույգերի դեպքում․ փորձարկված 25 զույգերից միայն այս չորսն են տվել այդ արդյունքը։ Սիներգիայի պաշտոնական վերլուծություն չի կատարվել, ուստի ճիշտ ձևակերպումն է՝ այս պայմաններում ակտիվ համակցություն, ոչ թե ապացուցված սիներգիա։

Կենսաթաղանթի փորձարկման ընթացքում ուսումնասիրվել են երիտասարդ, քայքայված կենսաթաղանթից առանձնացված բջիջներ, ոչ թե ներթափանցումն ամբողջական հասուն կենսաթաղանթի մեջ։ Կուլտուրաներն աճեցվել են հինգ օր, նոսրացվել և տեղափոխվել խորշավոր թիթեղների մեջ ևս հինգ օրով, հաստատվել բյուրեղային մանուշակագույնով ներկմամբ, ապա քերելով առանձնացվել՝ դեղերի ազդեցությունից առաջ։ Մեկ mL-ում 5 միկրոգրամ կոնցենտրացիայով միայն մեթիլենային կապույտի կիրառման դեպքում ցուցանիշը մինչև 6-րդ օրը նվազել է մինչև 2.3 անգամ 10-ի 2-րդ աստիճան՝ լինելով առանձին նյութերի լավագույն արդյունքներից մեկը, բայց ոչ զրո։ Մեթիլենային կապույտ պարունակող երկու համակցությունների դեպքում մինչև 6-րդ օրը ցուցանիշը հասել է զրոյի, ինչպես նաև ցիպրոֆլոքսացին պարունակող երկու համակցությունների դեպքում։

Հեղինակները նշել են նույն սահմանափակումները, որոնք կնկատեր ուշադիր ընթերցողը՝ երիտասարդ, քերված կենսաթաղանթ՝ հին և ամբողջականի փոխարեն, բոլոր դեղերի համար մեկ հարմար կոնցենտրացիա՝ յուրաքանչյուր դեղի իրատեսական առավելագույն կոնցենտրացիայի փոխարեն, միայն ազիթրոմիցինի կամ ռիֆամպինի շուրջ ընտրված զույգեր, մեկ շտամ, առանց կենդանիների և առանց հիվանդների։ Երեք դեղից բաղկացած համակցությունների հետագա ուսումնասիրությունն առաջարկվել է, բայց չի ներկայացվել որպես կատարված աշխատանք։

Ուսումնասիրությունների կառուցվածքի համեմատություն

Աղյուսակը սեղմ ձևով ներկայացնում է այս հոդվածի հիմնական միտքը։ Վերջին սյունակից ձախ ամեն ինչ կուլտուրայի հետ աշխատանք է։ Երկու հոդվածներից ոչ մեկում չկա վերջին սյունակին համապատասխանող տվյալ։

Bartonella-ն Borrelia չէ

Երկու հոդվածներում էլ հիշատակվում է Borrelia burgdorferi-ն՝ Լայմի հիվանդության սպիրոխետը, քանի որ ներկանյութով թեստը ծագել է նույն լաբորատորիայում ավելի վաղ կատարված՝ Borrelia-ի ստացիոնար փուլի ուսումնասիրություններից, որտեղ մեթիլենային կապույտն ու դապտոմիցինը նույնպես ակտիվություն էին ցուցաբերել։ Այդ պատմությունը օգտակար համատեքստ է և հաճախակի սխալների աղբյուր։

Bartonella-ի մասին երկու հոդվածներից ոչ մեկի փորձերում Borrelia-ն չի փորձարկվել Bartonella-ի հետ կողք կողքի։ Միկրոօրգանիզմները տարբեր են, միջավայրերը տարբեր են, կոնցենտրացիաները տարբեր են, իսկ Bartonella-ի թաղանթի վրա մեթիլենային կապույտի ենթադրյալ ազդեցությունը ներկայացվել է որպես հետագա ուսումնասիրություն պահանջող ենթադրություն։ Արդյունքները չպետք է տարածել մի տեսակից մյուսի վրա, և հոդվածներից ոչ մեկը չի հիմնավորում մակաբույծների մասին լայն պնդումներ։ Borrelia-ի և Bartonella-ի պերսիստեր բջիջների համեմատությունը հենց այս պատճառով է տարանջատում այս երկու գիտական գրականությունները։

Ինչու կուլտուրայի արդյունքները չեն վերածվում բուժման սխեմայի

Bartonella-ի համար մեթիլենային կապույտով բուժման սխեմայի որոնումների նկատմամբ հետաքրքրությունը հասկանալի է։ Այս հոդվածներն են պատճառը, որ այդ արտահայտությունը պետք է դիտարկել որպես նախազգուշացնող ազդանշան, ոչ թե գնումների ցուցակ։

Նախ՝ խորշում մեկ mL-ում 5 միկրոգրամը դեղատոմս չէ։ Այդ ցուցանիշը չի ներառում ներծծումը, բաշխումը, սպիտակուցների հետ կապումը, ներբջջային ներթափանցումը կամ տանելիությունը։ Հեղինակներն այն ընտրել են որպես հակաբիոտիկների առավելագույն կոնցենտրացիաների մոտավոր միջին և նշել, որ հետագա աշխատանքներում յուրաքանչյուր դեղ պետք է կիրառվի իր իրատեսական մակարդակով։

Երկրորդ՝ զրո գաղութը նշանակում է գաղութների բացակայություն ցանքսի տվյալ պայմաններում, ոչ թե ստերիլ հյուսվածք։ Պերսիստեր բջիջները, ներբջջային բակտերիաները և նմուշառման սահմանափակումները մնում են ագարային թիթեղից դուրս։

Երրորդ՝ խորշը ստերիլացնող համակցությունները կարող են օրգանիզմում չգործել կամ վնաս պատճառել։ Ազիթրոմիցինի ու մեթիլենային կապույտի և ռիֆամպինի ու մեթիլենային կապույտի համակցությունները լաբորատոր ազդեցության մակարդակներով լաբորատոր զույգեր են։ Առանց կենդանիների ֆարմակոկինետիկ տվյալների և մարդկանց մասնակցությամբ վերահսկվող ուսումնասիրությունների տվյալների՝ չկա ո՛չ դեղաչափ, ո՛չ տևողություն, ո՛չ օգուտ-ռիսկ հարաբերակցություն։ Տարբերակները դիտարկող ցանկացած անձ պետք է դրանք քննարկի բժշկի հետ և ծանոթանա, թե երբ է մեթիլենային կապույտի կիրառումը պահանջում բժշկական հսկողություն՝ նախքան թասում ստացված տվյալներից որևէ եզրակացություն անելը։

Այս հոդվածներով հիմնավորվող սահմանափակ եզրակացությունը հետևյալն է․ մեթիլենային կապույտն ունի կրկնելի ակտիվություն չաճող B. henselae JK53-ի նկատմամբ in vitro, այդ թվում՝ երկու դեղից բաղկացած լաբորատոր համակցություններում, իսկ համակցությունների և կենսաթաղանթից ստացված բջիջների վերաբերյալ ամենաուժեղ արդյունքները ստացվել են 2020 թվականի ուսումնասիրության մեջ։ Մնացած ամեն ինչ, ներառյալ այն, թե արդյոք այդ ակտիվությունը նշանակություն ունի մարդկանց բարտոնելոզի համար, մնում է չփորձարկված։