Nýtt metýlenblátt og retikulocytlitning: eitt serstakt litevni og ein háttur við livandi kyknum

Ein lesandi fyrireikar eina retikulocytteljing, bíleggur metýlenblátt, blandar tað við blóð og sær næstan einki. Ein flokksfelagi brúkar eina fløsku merkta nýtt metýlenblátt og fær týðiligar bláar træðrir inni í einum parti av teimum reyðu blóðkyknunum. Fyrri lesandi heldur, at seinna flaskan er nýggjari ella meira konsentrerað. Hon er hvørki. Hon inniheldur eina aðra sameind.

Hetta er hugtaksmisskiljingin aftan fyri flestu misskiljingar á hesum øki. Navnið bendir á, at nýtt metýlenblátt er ein betrað framleiðslulot av metýlenbláum. Evnafrøðin sigur nakað annað. Nýtt metýlenblátt N er eitt serstakt fenotiazinlitevni við egnum Colour Index-nummari, egnum substituentmynstri og egnum standardiseraðum leikluti í blóðfrøði. Tá ið hesin munurin er greiður, verður restin av háttinum lættari at skilja: hví kyknurnar skulu vera livandi, tá ið tær verða litaðar, hvat verður talt sum ein retikulocytur, hvønn leiklut Heinz-likam hava, og nær briljant kresýlblátt kemur inn í myndina.

Stutta svarið

Nýtt metýlenblátt N, reagensið til blóðfrøði, verður vanliga eyðmerkt sum Basic Blue 24 í PubChem-skrásetingini fyri nýtt metýlenblátt, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, við formlinum C18H22ClN3S. Vanligt metýlenblátt er metýltioniniumklorid, Basic Blue 9, í síni PubChem-skráseting, C.I. 52015, CAS 61-73-4, við formlinum C16H18ClN3S. Bygnaðurin í nýggjum metýlenbláum hevur tveir metýlbólkar á ringinum og etýlaminosíðuket ur, har metýlenblátt hevur dimetýlaminobólkar. Hesin munurin broytir litningareginleikarnar. Blóðfrøðiligar lærubøkur lýsa vanligt metýlenblátt sum eitt lutfalsliga vánaligt litevni til retikulocytar og nýtt metýlenblátt sum djúpari og javnari í litningini. Hesin samanburður er samandráttaður í evnisgreinini hjá ScienceDirect um nýtt metýlenblátt.

Ja, nýtt metýlenblátt er eitt supravitalt litevni. Supravital litning merkir litning av livandi kyknum, eftir at tær eru tiknar úr kroppinum og áðrenn fiksering, sum allýst í NCBI-yvirlitinum um meginreglur fyri supravitala litning. Bæði nýtt metýlenblátt og briljant kresýlblátt hoyra til henda bólkin, og CLSI-standardurin fyri retikulocytar viðger beinleiðis nýtt metýlenblátt sum eitt supravitalt litevni. Lesandi bólka hetta stundum saman við Romanowsky-litning av fikseraðum strokum. Tann hugsanarhátturin riggar ikki her. Fikserar tú fyrst, riggar hátturin ikki longur.

Hjá lesarum, ið kanna líknandi litevnisnøvn, viðger metýlblátt mótvegis metýlenbláum eina aðra og størri misskiljing millum eitt anióniskt triarýlmetanlitevni og katiónisku fenotiazinfamiljuna. Yvirlitið yvir starvsstovulitning setur supravitalt arbeiði í samanhang við hættir til fikseraðar strokar, og vegleiðingin um skapfrøði hjá blóðkyknum vísir, hvar meting av retikulocytum hoyrir heima í breiðari differentialteljing.

Ein ávaring viðvíkjandi vørulistum: ein serstakur zinkklorid-tvífalt saltformur av nýggjum metýlenbláum finst undir CAS 6586-05-6. Ein háttalýsing eigur tí at tilskila saltform og veitara, ikki bert vanliga navnið.

Hvat supravital litning í veruleikanum ger

Ein retikulocytur er ein ung reyð blóðkykna, sum hevur mist kjarnan, men framvegis hevur leivdir av ribosomalum RNA. Í einum ólitaðum vátum preparati er hetta RNA ósjónligt. Supravitalt litevni fer inn í livandi kyknuna og fellir ella savnar hetta RNA í blá korn og træðrir, tað net- og tráðalíka tilfarið, sum sæst við oljuimmersión. Netið er tí eitt úrslit av litningini, ikki ein frammanundan gjørd beinagrind, ið bíðar eftir liti. Tí hava mannagongdarviðurskifti, so sum litevniskonsentratión, buffari, lutfallið millum blóð og litevni, hiti og tíð, eins stóran týdning og navnið á litevninum.

Í verki krevur hetta eina fasta arbeiðsrøð: blanda fyrst antikoagulerað blóð við litevni, inkubera, ger síðan strokar og kanna teir ófikseraðar og uttan mótlitning. Fiksering áðrenn litning, ella mótlitning sum fjalir veikar træðrir, oyðileggur upplýsingarnar, sum teljingin byggir á.

Ein mannagongd til retikulocytar við nýggjum metýlenbláum

Eingin einstøk samanseting er alment galdandi, so upplýs ta, ið verður brúkt. Tríggir skjalfestir variantar vísa breiddina.

Klassiska mannagongdin av Brecher-slagi brúkar umleið 0.5 prosent nýtt metýlenblátt við kaliumoxalati, blandað í jøvnum rúmdum við væl blandað EDTA-blóð og inkuberað í umleið 10 til 15 minuttir við rúmhita. Eftir varliga endurblanding verða tunnir, kílaformaðir strokar gjørdir, luftturkaðir og kannaðir ófikseraðir undir 100x oljuobjektivinum. NCBI-mannagongdin til retikulocytteljing lýsir hetta arbeiðsgongdina og teljirammuna, sum verður brúkt saman við henni.

Dacie- og Lewis-varianturin brúkar 1.0 prosent nýtt metýlenblátt í citrat-saltloysn, blandað við 2 til 4 rúmdum av blóði og hildið við 37 C í 15 til 20 minuttir, áðrenn strokar verða gjørdir. Ein nýggj harmoniseringsútgáva av CLSI H44-mannagongdini brúkti eina veikari loysn við 0.1 prosent í fosfatbufferaðari saltloysn við pH 7.4, við inkubering við 20 C í 10 minuttir og ongari fiksering, sum lýst í NMB-harmoniseringskanningini frá 2026.

Teljireglurnar eru tær somu fyri allar variantarnar. Tel eina kyknu sum retikulocyt, tá ið hon inniheldur í minsta lagi tvey atskild blálitað korn ella tráðabrot; hetta útilokar einstakar litevnisavsetingar. Tel í minsta lagi 1,000 reyðar blóðkyknur í vanligum arbeiði og upplýs retikulocytar sum prosentpart. Við lágum prosentparti krevur hagfrøðin fleiri kyknur. Eitt yvirlit yvir CLSI H44-hættirnar vísir á, at við umleið 1 prosent retikulocytum krevjast umleið 4,400 kyknur fyri at fáa teljivariatiónina niður á 5 prosent, í CLSI H44-yvirlitinum hjá De Gruyter. Ein Miller-okularskiva ger stórar teljingar praktiskt møguligar. Filtrera litevnið ella ger eina fríska loysn, tí botnfall kann líkjast kornutum inklusiónum.

Heinz-likam í sama preparati

Sami supravitali strokur kann eisini vísa Heinz-likam, sum eru samansavningar av oxideraðum og denatureraðum hemoglobini heldur enn RNA-leivdir. Í preparatum við nýggjum metýlenbláum síggjast tey sum rund likam, ofta eitt einstakt nær membranini, ið litast ljósari blá enn net- og tráðalíka tilfarið. Tey varðveitast illa við fiksering og mótlitning, so kanna ófikseraða strokin. Ein nýggj mannagongd við 20 mikrolitrum av EDTA-blóði og 20 mikrolitrum av 1 prosent nýggjum metýlenbláum og 15 minuttum av inkubering taldi kyknur við Heinz-likamum millum 250 erytrocytar, í PMC-kanningini, sum lýsir hesa mannagongd.

Tveir munir fyribyrgja skeivari tulking. Í fyrsta lagi lita metýlviolett og krystalviolett Heinz-likam sterkari enn nýtt metýlenblátt, sum nevnt í evnisgreinini hjá ScienceDirect um Heinz-likam. Nýtt metýlenblátt er eitt hent val, tá ið retikulocytar og Heinz-likam verða mett saman, men ikki sterkasta litevnið serliga til Heinz-likam. Í øðrum lagi geva HbH-inklusiónir við alfa-talassemiueyðkenni nógvar smáar prikkar um alla kyknuna eftir supravitala litning, meðan klassisk Heinz-likam eru færri, størri og ofta knýtt at membranini. Litevnisavsetingar eru triðja fyribrigdið, sum kann líkjast teimum: tær liggja uttan fyri fokusflatan hjá kyknunum og eru ymiskar frá einum sjónøki til annað.

Briljant kresýlblátt mótvegis nýggjum metýlenbláum

Bæði litevnini eru supravital litevni til retikulocytar, men standardiseringin gevur øðrum teirra framíhjárætt. CLSI H44-A2-hátturin til retikulocytar, sum varð mentur saman við International Council for Standardization in Haematology og er skrásettur á CLSI H44-standardsíðuni, ásetur litning av EDTA-blóði við nýggjum metýlenbláum sum manuella samanburðarháttin. Klassisk undirvísing í blóðfrøði er samd um útsjóndina: nýtt metýlenblátt gevur djúpari og javnari tráðalitning, meðan briljant kresýlblátt er meira skiftandi millum framleiðslulot og sýni.

Hesin leikluturin krevur tó eitt fyrivarni. ICSH-vegleiðingin um meting av greiningartólum góðtekur manuella mikroskopi við nýggjum metýlenbláum sum samanburð við ein tilvísingarhátt, men lýsir hana sum subjektiva og lutfalsliga óneyva; tilvísingarhættir við flótcytometri verða tiknir fram um, har teir eru tøkir. Ein samanburður av 100 sýnum frá 2022 fann minni systematiskt frávik frá greiningartólinum við briljant kresýlbláum enn við nýggjum metýlenbláum, sum lýst í PMC-samanburðinum av litningarháttum. Ein fakliga haldgóður samandráttur til lesandi er: brúka nýtt metýlenblátt sum standardiseraða manuella samanburðarháttin, eftirkanna einhvønn staðbundnan hátt við briljant kresýlbláum móti honum ella móti automatiseraðari greining, og vænta størri spjaðing við manuellari mikroskopi í báðum førum. Eldri standardiseringsbókmentir mæltu eisini til reinsað Azure B sum eitt evnafrøðiliga reinari alternativ, tí handilslig litevnislot vóru ymisk, í Marshall-kanningini um Azure B. Hetta greiðir frá, hví reagensgóðska framvegis verður nevnd í umrøðum av hættum.

At sleppa undan vanligu mistøkunum

Fýra mistøk eru orsøkin til flestu miseydnaðar fyrireikingar. At bíleggja vanligt metýlenblátt heldur enn nýtt metýlenblátt N gevur veika litning orsakað av evnafrøðini, ikki arbeiðsháttinum. Fiksering ella mótlitning áðrenn avlesing tekur supravitala signalið burtur. At telja litevnisbotnfall sum korn ger úrslitið ov høgt; tveggja-korna-reglan og filtrerað litevni fyribyrgja hesum. At telja ov fáar kyknur við lágum retikulocytprosentparti gevur eitt tal, sum sær neyvt út, men hevur víð álitisbil. Hvørt mistak hevur sama eyðkenni: tann, ið mikroskoperar, gevur mikroskopinum skyldina fyri tað, sum reagensstigið avgjørdi.