Máting av ávirkanini hjá metylenbláum á mitokondriur: súrevni, ATP og membranspenningur

Hugsa tær, at ein starvsstova setur metylenblátt til mitokondriur við skerdari anding og sær súrevnisnýtsluna vaksa. Tann nærliggjandi setningurin at skriva er, at litevnið endurreisti mitokondriufunktiónina. Tann setningurin kann vera skeivur. Súrevnisstreymi, ATP-myndan og membranspenningur eru trý ymisk hugtøk. Tey hoyra til sama frumulut á sama hátt, sum trygdaravrit, samstilling og deiling hoyra til somu skýggjamappu: tey eru skyld, men fylgja ymiskum reglum. Verður eitt tikið fyri eitt annað, verður tulkingin skeiv, hóast hvør einstøk máting er tøkniliga røtt.

Metylenblátt ger hesa samanblanding sannlíka, tí tað tekur lut í skipanini, sum tað mátar. Tað gongur í redoksumrás, tekur ímóti elektronum fyrr í ketuni og letur tær frá sær seinni í ketuni, er ein lipofil katjón, sum savnast í mitokondrium við uppbygdu orkuspenningsfalli, og er eitt sterkt blátt evni, sum absorberar og sendir út ljós í somu bylgjulongdarøkjum sum vanligir probar. Ein einstøk máting kann ikki bera alla ta byrðuna. Tað álítandi mynstrið, sum sæst í mitokondriukanningunum úr Budapest, er at máta súrevnisstreymi saman við ATP-myndanartíðni, membranspenningi og frígeving av vetnisperoksidi, við litevnisserskildum kontrollum á hvørjum stigi.

Respirometri mátar súrevnisstreymi, ikki orkuframleiðslu

Respirometri við høgari upploysn, antin við Oroboros Oxygraph ella Seahorse-greinara fyri streymi uttan fyri frumur, sigur eitt: hvussu skjótt súrevni verður redusert. Hon sigur ikki, hvussu nógvar protónir vórðu pumpaðar fyri hvørja elektron, hvussu nógv av gradientinum varð varðveitt, ella um ATP-syntasa nýtti hann.

Orðavalið hevur týdning. Í avbyrgdum mitokondrium gevur substrat uttan ADP lekaanding, substrat við mettandi ADP gevur kapasitetin fyri oksidativari fosforylering, og titrering við einum frákoplara gevur hægsta kapasitetin fyri elektronflutningi. Í heilum frumum eru samsvarandi Seahorse-mátini grundanding, oligomycinviðkvom ATP-tengd anding, protónleki, hámarksanding ásett við FCCP og ikki-mitokondrial súrevnisnýtsla, sum er mótstøðufør móti rotenone og antimycin. At kalla Seahorse-úrslit State 3 og State 4 gevur teimum eina nágreiniligheit, sum fyrireikingin ikki loyvir, sum Agilent Mito Stress Test-karmurin ger greitt.

Metylenblátt brýtur tað nærliggjandi sambandið millum meira súrevni og meiri orku. Í avbyrgdum mitokondrium úr marsvínahjarna økti 100 nM til 1 uM av litevninum súrevnisnýtsluna í hvíld við glutamati saman við malati, succinati og alfa-glycerofosfati sum substratum. Við alfa-glycerofosfati var økingin umleið 64 prosent, men ADP-stimbraða andingin í frískum mitokondrium var í høvuðsheitum óbroytt, sambært kanningini av avbyrgdum heilamitokondrium. Tí lekin øktist, meðan ADP-stimbraði streymurin var óbroyttur, minkar roknaða andingarkontrolllutfallið. Henda minking merkir ikki, at litevnið skaddi mitokondriurnar. Hon merkir, at litevnið legði eina súrevnisnýtandi redoksumrás afturat vanligu andingini. Ein kanning av súrevnisnýtslu við metylenbláum, sum bert vísir økingina, hevur mátað veruliga evnafrøði, men sagt einki um varðveitslu av orku.

Endurreisnarroyndirnar vísa sama mun í størri mátistokki. Tá Complex I varð blokerað, varð súrevnisstreymurin endurreistur umleið trífalt, meðan ATP-myndanin bert varð endurreist umleið 1.5-falt. Meira súrevni náddi elektroduni. Ein minni partur av tí varð nýttur til ATP. Ein og hvør pástandur um betri oksidativa fosforylering krevur ATP-síðuna av roknskapinum, helst lýsta sum eitt lutfall av ATP fyri súrevni, har eisini verður upplýst, hvussu nevnarin er skilmarkaður.

ATP-kanningar máta myndanartíðni, sum innihald ikki kann koma í staðin fyri

Ein ATP-kanning svarar einum øðrum spurningi: hvussu nógv ATP verður myndað fyri hvørja tíðareind. Ein kinetisk máting, antin ljós frá luciferasa úr eldflugum, sum verður fylgt í fleiri minuttir, ella ein samanbundin hexokinasa- og glukosu-6-fosfat-dehydrogenasukanning lisin við 340 nm, gevur eina tíðni. Ein einstøk endapunktsmáting av samlaðum ATP gevur innihaldið, sum endurspeglar myndan minus nýtslu og einsamalt sigur lítið um oksidativa fosforylering.

Budapest-bólkurin nýtti ta samanbundnu ensymatisku háttalagið við hemda adenylatkinasu og fann, at 1 til 2 uM av metylenbláum økti ATP-framleiðsluna eitt sindur, men signifikant, í mitokondrium viðgjørdum við rotenone og antimycin. Hetta er verulig endurreisn, og hon er lutvís. Kanningin av TEGDMA-eiturvirkni gav sama slag av svari í einum øðrum modelli: 5 mM av tannlæknaliga monomerinum TEGDMA minkaði Complex I-tengda anding úr umleið 286 niður í 28 streymiseindir, og 2 uM av litevninum endurreisti hana til umleið 86.

Tvær kontrollir eru ófrávíkiligar við einum litaðum redoksevni. Fyrst skal oligomycin nýtast til at staðfesta, hvussu nógv av mátaðu ATP-myndanini er treytað av ATP-syntasu. Síðan skal ein endurfinningarroynd við tilsettum ATP gerast uttan frumur, við kendari nøgd av ATP, øllum hvarvevninum og júst teimum litevniskonsentratiónum, sum verða nýttar, í minsta lagi 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM. Litevnið kann absorbera útsent ljós, hemja fráboðarensymið ella broyta redoksevnafrøðina í hvarvevninum, og almenn vegleiðing um luciferasukanningar mælir til lívevnafrøðiligar mótkanningar fyri júst hetta slagið av órógvi. Rokna ikki við, at 1 uM er uttan mátiartefaktir, bara tí ljósdoyving vanliga er verri við hægri konsentratiónum.

Membranspenningsprobar máta býtið av litevni, ikki streymi

Safranine O, TMRM og TMRE, rhodamine 123 og JC-1 eru allar katjónir, sum kunnu fara gjøgnum membranir. Tær savnast í tí negativt lødda matriksinum sambært elektrokemiskari javnvág, so samlaða fluorescensin lýsir spenningin óbeinleiðis gjøgnum tað, hvar probin er. Eingin teirra mátar ATP ella elektronstreymi.

Hvør probi hóskar best til eina ávísa fyrireiking. Safranine O hóskar til avbyrgdar mitokondriur og permeabiliseraðar frumur, vanliga við umleið 2 uM, við eksitatión nær 495 nm og emissión nær 585 nm. Hon verður nýtt í einum ljósdoyvandi máti, har upptøka broytir samlaðu fluorescensina. TMRM og TMRE hóska til heilar frumur við lágari nanomolarari innløðing í ikki-ljósdoyvandi máti, har depolarisering sleppir litevninum út, og fluorescensin í mitokondriunum minkar; við høgari innløðing kann sjálvdoyving venda kósini á signalinum. JC-1 gevur eitt hent lutfall millum grønt og reytt, men er treytað av innløðing og mitokondriumassa, sum ger tað veikari til kvantitativt arbeiði enn væl kontrollerað TMRM. Hesir fyrimunir og vansar eru samanumtikið í eini nógv nýttari yvirlitsgrein um probar fyri mitokondrialan membranspenning.

Metylenblátt órógvar optiskt við júst teimum konsentratiónum, sum verða nýttar. Absorptiónsbondini nær 600 til 665 nm skarast við reyða emissión frá probum, so innanfilturávirkan, ljósdoyving og absorptión av eksitatiónsljósi eru øll trúlig. Litevnið er eisini ein onnur lipofil katjón, hvørs egna býti broytist við spenninginum, sum verður mátaður. Verjan er fleiri óheftar mátingar saman við blankroyndum: probi einsamallur, litevni einsamalt, probi saman við hvørjari litevniskonsentratión, full depolarisering við FCCP sum nulltilvísing og helst ein annar probi við øðrum optiskum eginleikum. Kanningin av umgongd um Complex III setti hetta fordømi við at endurtaka endurreisnina av membranspenningi við bæði safranine O og TMRM eftir hemjing við antimycin og myxothiazol og fáa somu kvalitativu endurreisn. Ein optiskur fráboðari er ein ábending. Tveir óheftir fráboðarar eru próvtilfar.

Tríggjar fyrireikingar, tríggir ymiskir spurningar

Avbyrgdar mitokondriur, permeabiliseraðar frumur og heilar frumur eru ikki umbýtiligar stillingar av viðkvæmi í somu kanning. Tær eru ymisk hugtøk við ymiskum arbeiðsmeginreglum.

Avbyrgdar mitokondriur varðveita elektronflutningsketuna, innaru membranina og virkisútgerðina í matriksinum, meðan plasmamembranin, cytosolið og netverksskipanin verða tikin burtur. Júst hetta er endamálið: substrat, ADP, hemlar og litevniskonsentratiónir eru nágreiniliga ásettar, so ein ávís leið kann eyðmerkjast. Kostnaðurin er, at náttúrlig substratveiting, signalgeving og eftirspurningur fara fyri skeytið.

Permeabiliseraðar frumur varðveita mitokondriurnar inni í stórum parti av frumuskipanini, meðan uttanífrá tilsett substrat og ADP sleppa gjøgnum opnaðu plasmamembranina. Tær eru rætta amboðið til at staðseta ein brek í eini substratleið í einum frumusamanhangi. Ov sterk permeabilisering skaðar ytru membranina, og stýring úr cytosolinum verður skolað burtur.

Heilar frumur varðveita alt: plasmamembranbarrieruna, reduserandi evni í cytosolinum, innvortis substratflutning, mitokondriunetverkið og eftirspurningin eftir ATP. Tær eru næst fysiologiini og longst frá mekanismuni, tí upptøka, reduktión og avbyrgd goymsla av litevninum øll ávirka, hvussu nógv mitokondriurnar veruliga verða útsettar fyri.

TEGDMA-kanningin nýtti tilvitað øll trý stigini: avbyrgdar heilamitokondriur til endurreisn av oksidatión og spenningi við litevninum, permeabiliseraðar stamfrumur úr tannpulpu fyrst og fremst til at staðseta brekið í Complex I-tengdari substratoksidatión og heilar stamfrumur til at kanna fysiologisku nettoávirkanina av 2 uM av litevninum á niðursetta súrevnisnýtslu. Fyri lesarar, sum samanbera mitokondrialar mátingar tvørtur um fyrireikingar, gevur fylgigrein um, hvussu metylenblátt flytur elektronir gjøgnum andingarketuna, bakgrundina fyri leiðunum, og vegleiðingin til at lesa andingarkanningar við metylenbláum viðger grundgevingarnar fyri konsentratiónum og hemlum.

Kontrollir, sum eitt redoksvirkið litevni krevur

Eitt evni, sum gongur í redoksumrás, krevur ein longri lista av kontrollum enn ein vanligur hemil, tí evnafrøði við litevninum einsamøllum kann líkjast lívfrøðiligum virksemi.

Til respirometri skal eitt kamar við bert buffara nýtast til at máta drift, eitt kamar við buffara og litevni uttan lívfrøðiligt tilfar, litevni saman við hvørjum uttanfrumu-reduserandi evni, sum er í kanningini, og at enda rotenone saman við antimycin til at skilmarka ikki-mitokondriala súrevnisnýtslu í heilum frumum. Legg til merkis, at redusert litevni verður enduroksiderað við at flyta elektronir til súrevni og mynda vetnisperoksid. Tí undirmetir ein blankroynd við bert litevni og ongum elektrondonori ta súrevnisnýtslu uttan frumur, sum kemur fram, tá NADH ella NADPH er tøkt.

Til vetnisperoksid eigur kalibrerað Amplex UltraRed saman við peroksidasu úr piparrót at verða valt fram um ikki-selektivu DCFDA-litevni. Staðfest við katalasu, og kanna, um úrslitið er treytað av lýsing, tí litevnið er ein fotosensibilisator. Kanningin av heilamitokondrium fann, at peroksidbyrðan øktist meira enn ferfalt longu við 100 nM av litevninum, meðan burturbeiningin varð seinni, og at peroksid varð myndað beinleiðis av reduseraðum litevni uttan superoksid sum millumstig. Nágreiningar um val av probum og ljóskontrollir hoyra til fylgigreinina um máting av reaktivum súrevnissløgum í litevnisroyndum, og breiðari spurningurin um, nær peroksid virkar sum signal heldur enn byrða, verður viðgjørdur saman við redoksjavnvág í frumum og pástandum um antioxidantar.

Fyri pástandir um leiðir skulu bæði hemjarastøðini í Complex III kannast: antimycin A á Qi-staðnum og myxothiazol á Qo-staðnum, umframt eitt endapunkt fyri Complex IV við cyanidi. Ein eldri kanning av músahjarna fráboðaði endurreisn við litevninum av anding, sum var blokerað við rotenone, men ikki við antimycin, meðan seinna kanningin av trimum djórasløgum fann lutvísa endurreisn við báðum hemlum og próvtilfar fyri beinleiðis reduktión av cytochrom c. Met umgongdina sum sambærliga við nýggjaru dátuni heldur enn endaliga staðfesta, tí litevniskonsentratión, hemjarastað, substratstøða og býti av litevninum øll flyta ta leið, sum sæst.

Talva til val av kanning

Nýt hesa talvuna til at velja mátingina eftir spurninginum, ikki øvugt.

Minnsta grundarlagið fyri einum sannførandi pástandi er at nýta somu litevniskonsentratiónir, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM, í mátingum av súrevnisstreymi undir leka-, ADP-, oligomycin- og frákoplingarumstøðum, ATP-myndanartíðni, membranspenningi við helst tveimum probum og kalibreraðari peroksidfrígeving við katalasu og frumufríum kontrollum. Fráboða alla ta samanbundnu røðina: súrevnisstreymi saman við ATP-tíðni, ATP fyri súrevni, spenningi og peroksidi. Hvørt einstakt av hesum tølunum einsamalt er ein máting, sum leitar eftir merking.