Metylenblátt og nitrogenmonoksid: NOS, cGMP og boðgeving í æðum

Spurningurin ljóðar einfaldur: tálmar metylenblátt nitrogenmonoksidi? Á starvsstovuni verður svarið býtt í fýra sjálvstøðugar spurningar, og hvør teirra krevur sína egnu roynd. At blanda teir saman er høvuðsorsøkin til, at tekstir um metylenblátt og nitrogenmonoksid kunnu ljóða sannførandi, men vera óneyvir.

Hugsa um nitrogenmonoksidboðið sum eina ketu við fýra liðum. Eitt gen verður transkriberað fyri at mynda nitrogenmonoksidsyntasa. Ensymið umskapar arginin til nitrogenmonoksid. Gassið diffunderar til málið, áðrenn tað reagerar við okkurt annað. Loysiligi guanylatkyklasin skrásetur tað og myndar sykliskt GMP. Almannakunngjørd gransking vísir árin av metylenbláum á hvønn lið, men prógvini koma frá ymiskum royndarskipanum, ymiskum styrkjum og ymiskum isoformum. Eitt úrslit við einum liði prógvar ikki virknað við einum øðrum.

Vanliga ketan, greitt lýst

Í einum æðaveggi gongur vanliga tilgongdin soleiðis. Eitt áreiti virkar á eina endotelkyknu. Endotelialur nitrogenmonoksidsyntasi, nevndur eNOS ella NOS3, myndar ein lítlan puls av nitrogenmonoksidi. Gassið diffunderar inn í slættvøddakyknuna við síðuna av, bindur seg at hem-bólkinum við redusaraðum jarni í loysiliga guanylatkyklasanum og skundar undir umskapanina av GTP til sykliskt GMP. Sykliskt GMP virkjar proteinkinasu G, kalsiumhandfaringin broytist, og vøddin slappar av.

Ein onnur keta er, sum eigur at verða hildin atskild. Undir ígerð ella ávirkan av cytokinum transkribera kyknur eitt annað ensym, inducerbaran nitrogenmonoksidsyntasa ella iNOS, eisini nevndan NOS2. Hann framleiðir størri og meira varandi streymi av nitrogenmonoksidi enn eNOS. Ein triði isoformur, neuronalur NOS ella nNOS, hoyrir til enn ein annan samanhang. Tá ein vísindagrein nevnir nitrogenmonoksidsyntasa uttan at tilskila isoformin, steðga so á og kanna, hvør varð mátaður. Yvirlitið yvir, hvussu metylenblátt flytur elektronir, leggur dent á tað sama fyri redoksmál sum heild: flutningsliðið ger einki einsamalt, og samstarvsparturin í hvørjum enda avger úrslitið.

Mátað sykliskt GMP er eisini eitt samlað úrslitsmát, ikki ein beinleiðis ensymkanning. Støðið endurspeglar syntesuna hjá kyklasa frádrigið niðurbrotið hjá fosfodiesterasum, serliga PDE5 í sløttum æðavødda. Ein lækking í sykliskum GMP merkir tí, at minni av boðnum náddi fram til skrásetaran. Hon sigur ikki í sjálvari sær, hvør liður svíkti.

Liður 1: minni iNOS-ensym verður myndað

Í makrofagum úr músum, sum vórðu stimbraðir við bakteriellum lipopolysakkaridi, interferon gamma ella báðum, forðaði metylenblátt væntaðu økingini í iNOS-proteini og minkaði munandi iNOS-boðbera-RNA í royndunum við transkriptión í makrofagum. Tað upplýsandi er tað, sum ikki broyttist. Niðurbrot av tálmaranum I kappa B alpha, fosforylering av NF kappa B og STAT1 og flutningur av hesum faktorunum inn í kjarnan hildu í stóran mun fram óbroytt. Tað, sum minkaði, var binding teirra til DNA. Hetta varð staðfest við kromatin-immunopresipitatión, sum vísti minni binding á iNOS-promotaranum.

Hetta er eitt árin á genstýringina undan broytingini í nøgdini av ensyminum, ikki ein bráðfeingis blokering av einum ensymi, sum longu er til staðar. Tað hoyrir til inflammatoriska boðgeving, har transkriptiónsfaktorar mugu binda seg at einum promotara, áðrenn protein verður myndað. Tað sigur einki beinleiðis um konstitutivt eNOS í eini æð í hvíld og eigur at verða lýst við hesum fyrivarnum.

Liður 2: NOS-ensymið, sum longu er til staðar, arbeiðir seinni

Ein rottukanning royndi eitt annað stig. Vaknar kallrottur fingu lipopolysakkarid í æð og tríggjar tímar seinni antin saltvatn ella metylenblátt við 3 mg per kg í æð. Virksemið hjá nitrogenmonoksidsyntasa í mediala basala hypotalamus varð mátað við umskapan av merktum arginini til citrullin í kanningini av NOS-virksemi í hypotalamus. Stress saman við saltvatni einsamøllum framkallaði nakað av kalsiumóheftum virksemi, og lipopolysakkarid økti tað til umleið tíggju ferðir støðið í samanberingarbólkinum. Metylenblátt tók burtur báðar framkallaðu partarnar. Kalsiumhefta konstitutiva virksemið broyttist ikki í hesum vevnaði við hesum skamti og á hesum mátingartíðspunkti.

Les úrslitið júst sum tað er skrivað: mátað virksemi av iNOS-slagi varð tálmað undir hesum umstøðum. Hetta er ikki ein máting av genúttrykki, og tað er ikki prógv fyri, at metylenblátt altíð er selektivt fyri iNOS fram um eNOS ella nNOS. Arbeiði við reinsaðum ensymum ger fyrivarnið enn greiðari. Í beinleiðis kanningum av reinsaðum nitrogenmonoksidsyntasa blokeraði metylenblátt fullkomiliga myndan av citrullini við 30 micromolar. Styrkurin, sum tálmaði virkseminum niður í helvt, var umleið 5.3 micromolar uttan superoksiddismutasa og 9.2 micromolar við honum, sum fráboðað í samanberingini av reinsaðum NOS og guanylatkyklasa. Ein onnur kanning av reinsaðum nNOS bendi á oksidering av hemi bundnum at ensyminum. Lærdómurin er, at beinleiðis NOS-tálming er verulig í avbyrgdum skipanum, men úrslitið úr hypotalamus kann ikki tøygjast til eina almenna staðfesting um, at metylenblátt letur alt konstitutivt NOS vera óávirkað allastaðni.

Liður 3: nitrogenmonoksid verður mist, áðrenn tað kemur fram

Greiðasta dømið um, at annað enn ensymblokering kann greiða frá eini lækking í sykliskum GMP, kemur frá dyrkaðum slættvøddakyknum úr lungnaslagæðum hjá kaninum. Royndarskipanin fór heilt uttan um kyknanna egna NOS við at tilseta nitrogenmonoksiddonorar beinleiðis. Síðan varð kannað, um metylenblátt framvegis tálmaði syklisku GMP-svarinum í superoksidkanningini í sløttum æðavødda.

Tríggir donorar vórðu royndir frá 1 til 100 micromolar: S nitroso L cysteine, natriumnitroprussid og eitt støðugt deaminerað analog nevnt MPANO. Allir øktu sykliskt GMP til millum umleið 1.5 ferðir og 12 ferðir upprunaliga støðið. Metylenblátt við 10 micromolar tálmaði teimum fyrstu báðum við 51 til 100 prosentum og læt MPANO-svarið vera óbroytt. Um metylenblátt bert blokeraði katalytiska staðið á kyklasanum, hevði hetta donorúrvalið verið trupult at greiða frá, tí allir tríggir enda við at ávirka sama ensym longri frammi í boðleiðini.

Tríggjar kontrolroyndir knýttu síðan mekanismuna til superoksid. Í fyrsta lagi endurskapti myndan av superoksidi uttan fyri kyknurnar við xanthini og xanthinoksidasa sama mynstur: CYSNO og nitroprussid vórðu blokerað, meðan MPANO var óávirkað. Í øðrum lagi elvdi metylenblátt til skamt- og tíðarhefta framleiðslu av superoksidi úr slættvøddakyknunum, mátaða við reduktión av cytokromi c. Í triðja lagi forðaði superoksiddismutasi fullkomiliga tálmingini, meðan katalasi ikki gjørdi tað. Hetta bendir á superoksid heldur enn hydrogenperoksid sum beinleiðis virkandi evnið í hesi royndarskipan.

Útgávan av royndini við samdyrking eigur eisini at verða lýst, tí hon vísir, hvar árinið fer fram. Endotelkyknur á dekkgløsum vórðu í stutta tíð samdyrkaðar við slættvøddakyknum, so ein endotelialur faktor, sum varð latin út við grundvirksemi, økti sykliskt GMP í slættvøddanum til tríggjar til átta ferðir upprunaliga støðið. Undanviðgerð av øðrum hvørjum kyknubólkinum við metylenbláum minkaði hetta boðið, og superoksiddismutasi bøtti lutvíst um árinið av undanviðgerðini av endotelkyknunum. Við øðrum orðum nýtist metylenblátt als ikki at virka inni í slættvøddakyknuni, sum skrásetur boðið. Tað kann minka boðið við at taka boðberan burtur á vegnum. Vegleiðingin til at lesa gransking um metylenblátt viðger hetta sum eina almenna reglu: nevnið fyrst, í hvørjum rúmi inntrivið fór fram, áðrenn tit nevna eitt molekylerkt mál.

At kalla hetta NOS-tálming hevði verið skeivt. Eingin syntasaliður var neyðugur fyri, at donorarnir skuldu virka, men kortini minkaði boðið.

Liður 4: sjálvur skrásetarin svarar minni

Beinleiðis árin á loysiligan guanylatkyklasa finnast, men styrkirnir hava týdning. Í samanberingini av reinsaðum ensymum, sum varð nevnd omanfyri, kravdi kyklasi stimbraður av nitrogenmonoksidi umleið 60 micromolar metylenblátt fyri at verða tálmaður niður í helvt, samanborið við umleið 5 til 9 micromolar fyri NOS. Sjálvt 1 millimolar gav bert eina lutvísa hámarksblokering. Hetta er ein munur upp á umleið seks til ellivu ferðir. Ein kyknuroynd við lágum micromolar-styrki, sum lækkar sykliskt GMP, kann tí ikki nevnast selektiv kyklasatálming bert við støði í talinum fyri sykliskt GMP.

Ein seinni redokskanning legði afturat eitt annað fyrivarni: metylenblátt óvirkjaði kyklasa, sum var virkjaður av nitrogenmonoksidi, við eini mekanismu, ið var øðrvísi enn einføld luftoksidering av jarninum í hemi. Skrásetarin kann sostatt verða tarnaður, men evnafrøðin er ikki endaliga greið. Munurin í styrki merkir, at árinini á superoksid og NOS eiga at verða útilokað fyrst við lágum micromolar-styrkjum. Her hoyrir kontroll av fosfodiesterasum eisini heima. Um niðurbrotið ikki varð mátað ella blokerað, kann minni uppsavning av sykliskum GMP samsvara við minni syntesu, skjótari niðurbrot ella bæði.

Hví hetta ikki kann minkast til eina einstaka staðfesting um blóðtrýst

Hvør liður varð staðfestur í eini aðrari skipan. Transkriptión í makrofagum er ikki tað sama sum ensymvirksemi í hypotalamus. Virksemi í hypotalamus eftir lipopolysakkarid er ikki tað sama sum endotelialur spenningur í hvíld. Ein endotelialur faktor, sum verður latin út við grundvirksemi í samdyrking, er ikki tað sama sum æðavídd stimbrað av einum agonisti. Dyrkaðar kyknur úr lungnaslagæðum við 10 micromolar metylenbláum eru ikki ein blóðrás hjá menniskjum. At leggja alt hetta saman í eina staðfesting sum, at metylenblátt hækkar blóðtrýst við at blokera nitrogenmonoksid, skúgvar júst teir munir til viks, sum kontrolroyndirnar vóru gjørdar fyri at varðveita.

Tríggjar kanningar halda frágreiðingini neyvari. Í fyrsta lagi skal isoformurin nevnast: eNOS fyri æðaspenning í hvíld, iNOS fyri framkallaðan inflammatoriskan streym og nNOS í neuronalum samanhangi og í ávísum royndum við reinsaðum ensymum. Í øðrum lagi skal nevnast, hvussu nitrogenmonoksidboðið verður veitt: við kyknanna egnu syntesu, við endotelialari útlating í grundvirksemi ella við einum ávísum donori sum CYSNO, nitroprussidi ella MPANO, tí tann støðugi donorurin stóð ímóti metylenbláum, meðan teir óstøðugu ikki gjørdu tað. Í triðja lagi skulu styrkurin og endurskapandi kontrolroyndin nevnast: endurskapan við superoksiddismutasa bendir á superoksid, vantandi árin av katalasa talar ímóti hydrogenperoksidi í hesi royndarskipan, eftirlíking við xanthinoksidasa vísir, at mekanisman er nóg mikið í sjálvari sær, og kanningar við reinsaðum ensymum skilja beinleiðis árin á katalysu frá tapi á vegnum.

Stutta samanfatingin er henda. Metylenblátt eigur heldur at verða viðgjørt sum eitt evni, ið órógvar boðgeving frá nitrogenmonoksidi til sykliskt GMP á fleiri støðum, enn sum ein selektivur kyklasablokkeri. Alt eftir royndarskipan og styrki kann tað minka bindingina hjá iNOS-transkriptiónsfaktorum, beinleiðis tálma NOS-ensymum, minka atkomuleikan hjá nitrogenmonoksidi við at mynda superoksid og tarna kyklasa, sum er virkjaður av nitrogenmonoksidi. Leikluturin hjá sykliskari GMP-boðgeving í æðakanningum og samanberingin av nitrogenmonoksiddonorum, sum verða nýttir í kyknukanningum viðgera hvør sína av hesum greinum nærri, og hættirnir, sum verða nýttir til at skilja redoksárin frá ensymárinum greiða frá, hví superoksiddismutasi saman við katalasa og einum støðugum donori sum kontroll kemur so ofta fyri í hesum granskingarbókmentum.

Eitt lágt virði fyri sykliskt GMP eftir metylenblátt vísir eina brotna ketu. Bert kontrolroyndirnar siga, hvør liður brast.