Metylenblátt og autofagi: AMPK, mTOR og royndir við nervakyknunum

Ímynda tær, at tú gert eina kyknuroynd, setur metylenblátt til og sært eitt proteinband, nevnt LC3-II, gerast myrkari á blotinum. Tað er freistandi at boða frá, at evnið „økir autofagi“, og so halda fram. Men tann tulkingin er ov tíðliga gjørd. Eitt myrkari LC3-II-band kann merkja, at kyknan myndar fleiri uppruddingarblaðrur, ella at blaðrurnar hópast upp, tí burturbeiningin er steðgað. Tær báðar tulkingarnar benda í hvør sína ætt, og rannsóknarbókmentirnar um metylenblátt í nervakyknunum hava dømi um báðar sløgini av próvtilfari. Henda greinin fer ígjøgnum, hvat í veruleikanum varð mált, greining fyri greining.

Makroautofagi, sum er tað slagið, ið verður kannað her, er skipanin hjá kyknuni til endurnýtslu av størri nøgdum av tilfari. Ein himnusekkur, nevndur fagoforur, veksur rundan um slitnar proteinir og organellur, letur seg aftur til eitt autofagosom, rennur saman við einum lysosomi, og innihaldið verður niðurbrotið og latið leyst til endurnýtslu. Nervakyknur eru bundnar at hesi tilgongd, tí tær ikki býta seg og tí ikki kunnu minka lutfallið av skaddum pørtum við kyknubýti. Tá ið endurnýtslan steðgar, hópast burturkast upp. Tá ið hon gongur, fær kyknan byggievni aftur undir strongd.

Hvat ein roynd við hippocampus-kyknum vísti

Høvuðskanningin av ígongdseting nýtti HT22-kyknur úr hippocampus hjá músum, sum vórðu settar undir strongd við at taka serum frá teimum í 24 tímar. Hetta tekur vakstrarfaktorar og trofisk boð burtur og setur bæði apoptosu og autofagi í gongd. Granskararnir greiddu frá, at metylenblátt minkaði um kyknudeyða á ein hátt, sum var treytaður av skamtinum, og at henda verjan var fylgd av teknum um makroautofagi.

Markørmynstrið var greitt. Spjadd LC3B-liting savnaðist í punkt kring kyknukjarnan frá umleið 20 nM av metylenbláum, og sterkasta LC3-I- og LC3-II-svarið var nær 1 μM. Bæði LC3B-I og LC3B-II øktust við skamti og tíð. Avgerandi var, at granskararnir fóru eitt stig víðari enn eina einstaka LC3-blotmáting. Teir settu 10 μM av klorokini til, sum forðar burturbeining í lysosomum, og funnu meira LC3-II umframt støðugari p62 í kyknum, sum vóru viðgjørdar við metylenbláum. Hetta mynstrið stuðlar eini umseting, sum er bundin at lysosomum, heldur enn bert upphóping. Teir vístu eisini, at klorokin lutvíst tók tann apoptosutálmandi virknaðin aftur. Tað knýtir verjuna at autofagi- og lysosomleiðini í hesum modellinum.

Úrslitið um boðgeving er tann parturin, sum oftast verður endurgivin skeivt. AMPK-boðgeving, máld sum fosforylerað AMPK og fosforylerað ACC, sum er eitt mál fyri AMPK longri niðri í boðleiðini, øktist eftir 12 og 24 tímar á ein hátt, sum var treytaður av skamtinum. AMPK-tálmarin Compound C, sum varð settur til í 20 μM teir síðstu 4 tímarnar, minkaði bæði um ACC-fosforylering og LC3-virkjan. Hinvegin varð eingin mátilig tálming sædd í fosforyleraðum mTOR. Í strongdum hippocampus-kyknum var niðurstøðan tí ígongdseting knýtt at AMPK eftir eini leið, sum eftir øllum at døma var óheft av mTOR. Sama mynstrið sást í livandi músum, har viðgerð við metylenbláum fekk makroautofagimarkørar at økjast í heilabørkinum og hippocampus.

Ígongdseting er ikki fullført gjøgnumstreymi

Her er munurin millum hugtøkini serliga avgerandi. Ígongdseting merkir, at skipanin í byrjanini av tilgongdini myndar fleiri autofagosom. Gjøgnumstreymi merkir, at innihaldið fer alla leiðina: innilokan, búning, samanrenning við lysosom, niðurbroting og endurnýtsla. Ein og hvør øking í LC3-II er ein ábending um ígongdseting, inntil ein gjøgnumstreymisroynd váttar restina av tilgongdini.

Vanliga gjøgnumstreymisroyndin mátar LC3-II við og uttan stutta tálming av lysosomum við til dømis bafilomycin A1 ella klorokini. Um viðgerðin veruliga ger myndingina skjótari, eigur tálming av niðurbrotingini at fáa LC3-II at økjast enn meira. Ein tandem mCherry-GFP-LC3-reportari gevur eitt annað innlit: bygnaðir lýsa gult áðrenn samanrenning við lysosom og bert reytt eftir, at sýran hevur sløkt GFP-signalið. Fleiri punkt, sum bert lýsa reytt, stuðla tí, at tilgongdin heldur fram inn í súr autolysosom. Minkandi p62-proteinnøgd kann stuðla umseting av innihaldinum, men fyrivarni er neyðugur, tí sjálv p62-transkriptiónin svarar strongd og eigur at verða kannað á mRNA-stigi.

Eftirlitslistin niðanfyri vísir fyri hvørja greining í hesum rannsóknarbókmentunum, hvat hon mátar, og hvat hon ikki kann prógva einsamøll. Lesarar kunnu nýta hann til allar framtíðar pástandir um makroautofagi, eisini grundgevingar um føstu og langlívi, sum byggja á hesar markørar.

Legg merki til eina orðingarvillu, sum talvan hjálpir at fyribyrgja. Fosforylerað ACC er tað formið, har ensymvirksemið er tálmað. Ein øking í tí vísir boð frá AMPK, ikki virkjan av ACC.

Orðingin „tálming av makroautofagi tók nervakyknuverjuna burtur“ krevur sama neyvleika. Í HT22-modellinum merkir hon, at órógv av autofagi- og lysosomleiðini tók fyrimunin fyri yvirlivilsi, sum metylenblátt gav undir serumfrátøku, burtur. Hetta stuðlar, at autofagi var neyðug ella hevði ein leiklut í hesum dyrkingarílætinum. Tað staðfestir ikki, at autofagi er einasti verjandi mekanisman hjá evninum, og tað prógvar ikki, at klorokin einans virkar gjøgnum autofagi. Ílegubroytingar, sum órógva ATG5, ATG7 ella ULK1, høvdu verið neyðugar fyri at styrkja pástandin um orsakasamband.

Tvær leiðir inn í somu skipan

Ein einføld lýsing hjálpir. Orkustrongd økir AMPK-virksemið, AMPK virkjar ULK1-kompleksið, og autofagi byrjar. Vakstrarfaktorar og føðsluevni økja mTORC1-virksemið, mTORC1 tálmar ULK1, og autofagi verður ikki sett í gongd. Longri niðri í leiðini eftir ULK1 setur Beclin-1- og VPS34-kompleksið myndingina av fagoforinum í gongd, LC3-I verður lipiderað til LC3-II, autofagosomið letur seg aftur og rennur saman við lysosominum, og innihaldið verður niðurbrotið samstundis sum p62 verður umsett.

Myndin setur hvørt úrslit um metylenblátt inn í hesa lýsingina: hippocampus-úrslitið við AMPK-greinina og úrslitið úr undangongukyknunum við mTOR-greinina.

Henda fatan greiðir frá tí, sum kann tykjast ósamsvarandi við seinnu kanningina hjá Xie. Í neuralum undangongukyknunum hjá rottum, sum vóru í kyknuvøkstri, fann ein onnur roynd, at 5 μM av metylenbláum tálmaði kyknuvøkstri og fremjaði hvílustøðu. Kyknum, sum vóru Ki67-positivar, fækkaði á degi 1 og 3, meðan differentiering til nervakyknur, sum longu var ásett, helt fram ótarnað. Har virkaði mekanisman gjøgnum tálmaða mTOR-boðgeving: minni samlað mTOR og fosforylerað mTOR saman við lægri p70S6K- og 4EBP1-tjáning umframt niðurstýring av cyklinum E1, B1, D1 og D2. Tann mest eyðsýndi eginleikin var hvílustøða hjá undangongukyknunum, sum høvundarnir knýttu at seinkaðari kyknuelding, ikki bjarging av strongdum hippocampus-kyknum.

Tær báðar greinarnar eru ikki í mótsøgn. AMPK og mTOR sameina boð eftir umstøðunum og eru ikki fastir av- og á-kontaktir. Ein strongd kykna, sum líkist eini nervakyknu, kann virkja AMPK uttan mátiliga mTOR-tálming, meðan ein undangongukykna, sum verður stimbrað av mitogenum, kann svara sama evni við at minka um mTOR-bundið vakstrarvirksemi. Kyknuslag, strongdarumstøður, styrki og mátingartíðspunkt gera av, hvør grein hevur størsta leiklutin. Tí hoyra ávirkanirnar hjá metylenbláum á orku í mitokondrium og redox-tilgongdir eisini við í somu mynd: sum ein yvirlitsgrein um mekanismur fyri nervakyknuverju lýsir, virkar evnið sum ein alternativur elektronberi, virkjar antioxidativa og apoptosutálmandi boðgeving, tálmar MAO og NOS og er knýtt at endurnýggjan av mitokondrium gjøgnum nýmynding og autofagi. Autofagi er ein grein av einum virknaðarmynstri við nógvum ávirkanum, ikki øll frágreiðingin.

Hvat royndirnar ikki vísa

Serumfrátøka eftirger trofiska og metaboliska strongd í einum dyrkingarílæti. Hon eftirger ikki føstu hjá einari heilari veru: glukosa, aminosýrur og sølt eru framvegis í grundmiðlinum, og eingin atferð knýtt at føðsluinntøku er til staðar. Styrkir í kyknudyrkingum frá 20 nM til 5 μM kunnu ikki roknast um til skamtir hjá menniskjum við einfaldari rokning, tí upptøka, proteinbinding, redox-støða, evnaskifti, upphóping í vevnaði og ávirkanartíð øll eru ymisk.

Eingin roynd við menniskjum er løgd til rættis fyri at vísa, at metylenblátt setur autofagiskt gjøgnumstreymi í gongd hjá sjúklingum. Próvtilfarið um mekanismur kemur framvegis frá kyknuroyndum, ex vivo-royndum og djóraroyndum, og yvirlitsgreinar lýsa enn próvtilfarið fyri kliniskari nýtslu sum fyribils. Tí vísa hesar kanningar ikki, at metylenblátt eftirger føstu, leingir lívið hjá menniskjum gjøgnum autofagi ella fullførir autofagiskt gjøgnumstreymi í mannaheilanum. Pástandir um føstueftirgerandi virknað og langlívi krevja sítt egna kliniska próvtilfar, og royndir við metylenbláum hjá menniskjum fyri onnur endamál gerast ikki autofagiroyndir bara av tí, at evnið er tað sama. Gransking í modellum fyri føðsluevnistrongd og langlívi eigur at verða lisin við hesum markinum fyri eyga.

Tá ið tú lesur næstu granskingargreinina, nýt eftirlitslistan í røttum rað. Spyr fyrst, hvør grein broyttist: AMPK, mTOR ella hvørgin. Spyr síðani, um LC3-úrslitið varð sett saman við eini gjøgnumstreymisroynd ella stendur einsamalt. Kanna síðani, um tálming av leiðini tók fyrimunin burtur, og við hvørjum háttalagi. Ein kanning, sum svarar øllum trimum, hevur grundarlag fyri einum sterkum pástandi um mekanismuna. Ein, sum bert svarar fyrsta spurninginum, hevur víst eitt boð, sum loyvir tilgongdini at byrja, og restin av leiðini er framvegis ikki kortløgd.