Metüleensinise neeldumisspekter ja molaarne neeldumistegur: mõõtetingimustega võrdlusandmed

Metüleensinise spekter näib lihtne, kuni püüate mõnda sellest saadud arvväärtust uuesti kasutada. Üks labor teatab molaarsest ekstinktsioonikoefitsiendist ligikaudu 82,000. Teine annab väärtuseks 67,000. Kolmas teatab väärtusest üle 100,000. Kõik kolm võivad oma mõõtmisi õigesti kirjeldada, kuid ükski neist ei ole selle värvaine universaalne konstant.

Segadus tekib kahe eri mõiste segiajamisest. Neelduvus on mõõtetulemus, mis saadakse konkreetse lahuse puhul konkreetses küvetis. Molaarne neeldumistegur, mida sageli tähistatakse epsiloniga, on selle lahuse mudeli parameeter. Kui metüleensinise assotsiatsiooniolek muutub, muutub ka mudel ja seega parameeter. Kasulik on käsitleda iga koefitsienti tingimustega varustatud väärtusena: lainepikkus, lahusti, pH või puhver, temperatuur, kontsentratsioonivahemik ja optilise tee pikkus peavad arvuga kaasas käima.

Monomeeri neeldumisriba lahjas vesilahuses

Lahjas vesilahuses paikneb metüleensinise katiooni valdav neeldumisriba ligikaudu 664 kuni 665 nm juures; eri seadmete ja kalibreerimisvalikute puhul esitatakse seda tavaliselt vahemikus 664 kuni 668 nm. See riba sobib kvantitatiivseks määramiseks, kui lahus on piisavalt lahja, et suurem osa värvainest oleks monomeersel kujul.

Kolm kirjanduses esitatud väärtust näitavad, miks tingimused on tähtsamad kui üksik esile tõstetud arv. Savi uurinud teadlased, kes hoidsid veeproovide kontsentratsiooni alla ligikaudu 7 mikromolaari ja kasutasid 1 cm küvette, teatasid epsiloni väärtuseks ligikaudu 82,000 M-1 cm-1 lainepikkusel 665 nm. See väärtus on erakordselt hästi dokumenteeritud väga lahjade veeproovide empiirilise kalibreerimissirge tõusuna. Hilisem deioniseeritud vees tehtud esmane kalibreerimine, kus kasutati kontsentratsioone 2.34 kuni 37.52 mikromolaari ja optilise tee pikkust 1 cm, andis värvaine üldkontsentratsiooni alusel väärtuseks ligikaudu 67,100 M-1 cm-1 lainepikkusel 665 nm. Madalam tulemus on ootuspärane, mitte vastuoluline, sest selle kalibreerimisvahemiku ülemises pooles leidub juba märkimisväärselt dimeeri. Kolmas väärtus, ligikaudu 73,460 M-1 cm-1 lainepikkusel 664 nm, pärineb tööst, milles pH 6.86 ja temperatuuri 293 K juures lahutati mõõdetud spekter monomeeri ja dimeeri osadeks, nagu on kokku võetud hiljutises metüleensinise fotofüüsika kriitilises ülevaates. See arv kirjeldab dekonvolutsiooniga eraldatud monomeerikomponenti, mitte neelduvuse ja värvaine üldkontsentratsiooni seose otsest tõusu.

Praktiline järeldus: valige koefitsient, mille tingimused vastavad teie proovidele, või tehke oma kalibreerimine. Ärge kasutage väärtust 82,000 30 mikromolaarse kontsentratsiooniga fosfaatpuhvris tehtavas analüüsis, eeldades, et lineaarsus kehtib endiselt.

Lühema lainepikkuse õlg on segu

Kontsentratsiooni suurenedes kasvab õlg ligikaudu 600 kuni 615 nm juures võrreldes 664 nm tipuga. Tänapäevastes uuringutes paigutatakse H-tüüpi dimeeri panus tavaliselt ligikaudu 605 kuni 610 nm juurde. Metüleensinise vesilahuste globaalne spektraalanalüüs eristab dimeeri maksimumi lainepikkusel 607 nm ja kõrgema agregaadi maksimumi lainepikkusel 600 nm ning monomeeri resonantsikomponente lainepikkustel 664 ja 650 nm. Terviktekst on kättesaadav avatud juurdepääsuga kirje PMID 33251415 kaudu.

Seda õlga ei tohiks nimetada puhtalt dimeeri neelduvuseks. Samasse piirkonda annab panuse ka monomeeri vibrooniline struktuur, seega on mõõdetud kõrgus panuste superpositsioon. Ühe globaalse sobitamise käigus leiti, et monomeeri ja dimeeri mudel ei kirjeldanud kogu vahemikku 1.1 mikromolaarist kuni 3.4 millimolaarini, kuid tetrameeri lisamine andis parima sobivuse; tetrameeri signaal oli tuvastatav juba alla 34 mikromolaari. Sobitatud komponentide neeldumistegurid olid suured: ligikaudu 107,800 M-1 cm-1 lainepikkusel 664 nm peamise monomeerikomponendi puhul, ligikaudu 101,400 dimeeri puhul lainepikkusel 607 nm ja ligikaudu 138,500 tetrameeri puhul lainepikkusel 600 nm, puhverdamata deioniseeritud vees, kus naatriumkloriidi kontsentratsioon oli 0 kuni 0.15 M ja temperatuur 282 kuni 333 K. Need on mudeli abil eristatud osad, mistõttu ei tohi neid kasutada empiirilise Beer–Lamberti seose tõusu asemel.

Dimerisatsiooni tugevust on otseselt kvantifitseeritud. Ühes uuringus saadi pH 6.86 ja temperatuuri 293 K juures dimerisatsioonikonstandiks ligikaudu 3,900 M-1. See suurusjärk selgitab, miks 5 mikromolaarne töölahus käitub peaaegu lineaarselt, kuid 50 mikromolaarne põhilahus mitte. Meetodi väljatöötamisel on kasulik kontrollida ligikaudu 610 nm juures mõõdetud neelduvuse suhet ligikaudu 665 nm juures mõõdetud neelduvusse. Kui see suhe suureneb koos kontsentratsiooniga, ei kirjelda epsilon lainepikkusel 664 nm enam üht muutumatut osakeste liiki.

Kontsentratsioonivahemikus, kus domineerib üks vastastikku muunduv osakeste paar, võib spektritel olla ühine isosbestiline punkt, mis vesilahuste katseseeriates asub ligikaudu 625 nm juures. Selge paigal püsiv punkt on kooskõlas kahe valdava osakeste liigiga. Kui punkt kontsentratsiooni suurenedes nihkub või kaob, käsitlege seda hoiatusena kõrgemate agregaatide tekke või tasakaalude nihkumise kohta, mitte seadme veana.

Lahusti, pH ja temperatuur muudavad spektrit

Vesi soodustab assotsiatsiooni. Dimetüülsulfoksiidi lisamine pärsib dimerisatsiooni, nihutab neeldumise ja fluorestsentsi maksimumid pikemate lainepikkuste poole ning suurendab fluorestsentsi kvantsaagist ligikaudu neljakordselt, nagu näitab metüleensinise lahustiuuring vees ja DMSO segudes, mis on indekseeritud kirjena PMID 30933781. Selles töös käsitletakse vesilahuste spektreid monomeeri ja dimeeri tasakaaluna, kus monomeeri neeldumine paikneb ligikaudu 650 kuni 670 nm ja dimeeri neeldumine ligikaudu 580 kuni 615 nm juures, ning tuletatakse spektritest dimerisatsioonikonstandid temperatuuril 293.15 K.

Alkoholid muudavad nii asukohta kui ka näivat tugevust, kuid ei kõrvalda agregatsiooni. Ühes algupärases võrdluses kontsentratsioonil 31.3 mikromolaari ja toatemperatuuril, mida kirjeldatakse metüleensinise lahustiuuringus, oli pikema lainepikkuse maksimum vees 665 nm, kuid metanoolis 655 nm; kogu lahuse näivad väärtused olid vees ligikaudu 37,100 ja metanoolis 60,800. Eraldi valideerimisel absoluutses etanoolis temperatuuril 298 K saadi maksimum lainepikkusel 655 nm ning epsiloni väärtus ligikaudu 68,000.

Tavapärased pH muutused mõjutavad spektrit vähem, kui paljud katseprotokollid eeldavad. Eespool viidatud kriitilises ülevaates märgitakse, et ligikaudu pH 2 kuni pH 12 vahemikus püsis maksimum ligikaudu 665 nm juures ning kuni pH 11-ni muutus tugevus vaid vähesel määral. Puhvri koostis ja ioontugevus võivad tulemusi mõjutada sama palju kui nominaalne pH, seega märkige üles tegelik puhver ja sool, mitte ainult pH-meetri näit. Tugev hape või tugev leelis on erijuht, sest pöörduva assotsiatsiooni asemel võib värvaine keemiliselt muutuda. Ka temperatuur ja sool nihutavad tasakaalu, mistõttu 2020. aasta vesilahuste uuringus muudeti mõlemat teadlikult.

Mõõtmine nii, et arvväärtus jääks kehtivaks

Kvantitatiivne töö põhineb Beer–Lamberti seosel: neelduvus võrdub epsiloni, kontsentratsiooni ja optilise tee pikkuse korrutisega. Lisaks tuleb tõendada, et lineaarne vahemik teie tingimustes tõepoolest kehtib.

Kasutage väikeste mikromolaarsete kontsentratsioonide korral 1 cm küvetti. Kui epsilon on ligikaudu 82,000, annab 5 mikromolaari neelduvuseks ligikaudu 0.41 ja 10 mikromolaari ligikaudu 0.82. Monomeerile keskenduva mõõtmise puhul puhtas vees on ohutum püsida ligikaudu 5 kuni 7 mikromolaari juures või sellest allpool, mitte laiendada kalibreerimist mitmekümne mikromolaarini. Kontsentreeritud põhilahuste puhul lühendage optilist teed, selle asemel et leppida neelduvusega, mis on tunduvalt üle 1.

Kasutage nullproovina täpselt sama maatriksit: sama puhtusastmega vesi, sama kaaslahusti osakaal, sama puhver ja samad soolad, kuid ilma värvaineta. Valmistage kalibreerimislahused samas maatriksis ja samal temperatuuril. Meetodi väljatöötamisel skaneerige kogu nähtava valguse vahemikku, ideaalis ligikaudu 550 kuni 750 nm, selle asemel et mõõta ainult ühel lainepikkusel. Jälgige kuju, mitte ainult kõrgust. Kui järjestikused lahjendused muudavad normaliseeritud kuju, sõltub süsteemi keemiline olek kontsentratsioonist. Stabiilne maksimum ja stabiilne neelduvuste suhe lainepikkustel 610 ja 665 nm on sobiva vahemiku tugevam tõend kui üksnes kõrge R-ruudu väärtus.

Dokumenteerige reagendi vorm. Kaubanduslik materjal võib olla veevaba metüültioniiniumkloriid või hüdraat, näiteks trihüdraat, seega peab põhilahuse arvutustes kasutatav molaarmass vastama pudelis tegelikult olevale ainele. Juba see samm selgitab osa laborite nominaalsete molaarkontsentratsioonide erinevustest. Sama täpsust on vaja siis, kui tulemusi kasutatakse kvantitatiivse analüüsi arvutustes, kui spektrid toetavad koostise stabiilsuse kontrolle ning kui lisandiprofiilide tõttu on vaja üle vaadata puhtus ja spetsifikatsioonid.

Kokkuvõte koos tingimustega

Kasutage seda tabelit labori dokumentatsiooni algmallina, mitte omavahel asendatavate konstantide allikana.

Metüleensinise neeldumise lainepikkus on seega lühike vastus pika joonealuse märkusega. Esitage mõõdetud tipp koos lahuse ja kontsentratsiooniga, milles selle mõõtsite. See harjumus ei lase ühel lahjas vesilahuses ligikaudu 664 nm juures saadud väärtusel muutuda ekslikult universaalseks konstandiks.