Metüleensinine insuldi ja aju hüpoperfusiooni uuringutes: mida kolm mudelit tegelikult näitavad

Ummistunud arter, toitaineteta jäetud rakukultuur ja ahenenud kaelaarteritega rott kõlavad ühe katse kolme variandina. Seda need ei ole. Igaüks esitab erineva küsimuse ning metüleensinine annab igaühes erineva vastuse. Kui need omavahel segi ajada, näib teaduskirjandus vastuoluline. Neid eristades ilmneb selge muster, mida määrab peamiselt ajastus.

See eristamine ongi käesoleva ülevaate mõte. Kolm mudelit on äge fokaalne insult, hapniku- ja glükoosipuudus koos sellele järgneva reoksügenatsiooniga rakukultuuris ning nädalaid kestev krooniline aju hüpoperfusioon. Neid ühendav oletatav mehhanism on mitokondriaalne, kuid tulemused erinevad, sest ainevahetuslik taust erineb.

Kolm mudelit vastavad erinevatele küsimustele

Äge fokaalne insult tekitatakse rottidel tavaliselt keskmise ajuarteri sulgemisega, mille lühend on MCAO. Trombisarnane sulgus tekitab isheemilise südamiku, mida ümbritseb penumbra ehk ohustatud kude, mida on verevoolu taastumisel võimalik päästa. Siin on küsimus selles, kas sekkumine aeglustab infarkti suurenemist või säilitab funktsiooni reperfusiooni ajal ja selle ümber.

Hapniku- ja glükoosipuuduse mudel, lühendiga OGD, toimib hoopis teisel skaalal. Kultiveeritud ajurakud viiakse peaaegu hapnikuvabasse keskkonda, kus puudub glükoos, ning seejärel tagasi tavapärasesse söötmesse. Puuduvad tromb, kollateraalne vereringe, vererõhk ja immuunsüsteem. Küsimus puudutab üksnes rakke: mis juhtub rakuhingamise, ATP ja elulemusega, kui substraadid kaovad ning seejärel taastuvad.

Kroonilise aju hüpoperfusiooni tekitamiseks kasutatakse rottidel mõlema unearteri püsivat sulgemist, mida nimetatakse 2VO mudeliks. Eesaju verevool väheneb ja jääb nädalateks madalaks. Puuduvad äkiline fokaalne infarkt ja erakorraline reperfusioon. Küsimus on selles, kas nädalatepikkune ainevahetuse toetamine säilitab veresooni, mitokondreid ja mälu pikaajalise vähenenud verevoolu tingimustes.

Seega ei ütle mälu paranemine pärast ühekuulist ravi 2VO mudelis otseselt midagi inimese aju päästmise kohta erakorralise trombektoomia ajal. See eristus on oluline, sest enamik optimistlikke kokkuvõtteid jätab selle tähelepanuta.

Äge insult: kaitse reperfusiooni korral, viivitus selle puudumisel

Kõige selgem ägeda insuldi tulemus pärineb mööduva MCAO ja järgneva reperfusiooni katsest. Rottidel suleti arter 60 minutiks ning seejärel hakati reperfusiooni alguses manustama veenisiseselt väikeses annuses metüleensinist, lisaannused anti 3 tunni pärast ja 2. päeval. MRI näitas, et kandjaainet saanud rühmas suurenes kahjustus 2. päevaks ligikaudu 19 protsenti, samas kui ravitud rühmas vähenes see ligikaudu 17 protsenti. Lõplikud infarktikolded olid ligikaudu 30 protsenti väiksemad ning neuroloogilised skoorid paremad 2. ja 7. päeval. Piltdiagnostika põhjal paranes nii isheemilise südamiku kui ka penumbra koe säilimine. Laiem neuroprotektsiooni käsitlev teaduskirjandus asetab selle reperfusiooniga ajastatud kaitse globaalse isheemia ja trauma uuringutulemuste kõrvale.

Pilt muutub, kui arter jääb suletuks. Püsiva MCAO katses aeglustas jätkuva isheemia ajal manustatud metüleensinine difusioonikahjustuse laienemist ja pikendas lühiajaliselt perfusiooni-difusiooni mittevastavust, parandades veidi kohalikku verevoolu, kuid lõplik infarktimaht 24 tunni möödudes ei erinenud oluliselt. See lükkas ohustatud koe infarktiks muutumist edasi, kuid ei asendanud veresoone taasavamist.

Kolmas ägeda insuldi uuring lisab täpsustusi mehhanismi ja annuse kohta. Kohe pärast arteri sulgemist kõhuõõnde manustatud ühekordne annus vähendas infarktimahtu kõige enam, ligikaudu 50 protsenti, keskmise annuse 5 mg/kg korral, mitte annuste 1 või 10 mg/kg korral. Samuti paranesid sensomotoorsed skoorid. Autorid seostasid seda mitokondrite struktuuri säilimise ja suurenenud mitofaagiaga ehk kahjustatud mitokondrite valikulise eemaldamisega. Seega on annus, manustamisviis ja manustamisskeem olulised ning rottidel kasutatud mg/kg väärtused ei ole inimese insuldiravi annused.

Rakukultuur: sama aine aitab või kahjustab sõltuvalt manustamise ajast

Astrotsüütide katse on kõige õpetlikum ja seda tsiteeritakse kõige sagedamini valesti. Hiire ajukoore primaarseid astrotsüüte hoiti 6 tundi raske puuduse tingimustes: hapnikusisaldus oli 0.1 protsenti ning söötmes puudusid glükoos, püruvaat ja seerum. Sellele järgnes 24 tundi reoksügenatsiooni koos substraatide taastamisega. Ligikaudu pooled rakud surid, mis võimaldab katses tuvastada nii kasulikku kui ka kahjulikku mõju.

Kui metüleensinine oli olemas puuduse faasis, halvenes rakkude elulemus, mitte ei paranenud. Kui seda lisati hoopis reoksügenatsiooni alguses, parandasid väikesed mikromolaarsed kontsentratsioonid eluvõimelisust ning suurendasid hapnikutarbimist, glükoosi omastamist ja ATP tootmist. Tavatingimustes suurendasid samad kontsentratsioonid glükoosi omastamist ligikaudu 89 protsenti kontsentratsioonil 0.1 mikromooli ja ligikaudu 200 protsenti kontsentratsioonil 1 mikromool liitri kohta. Pärast kahjustust säilisid glükogeenivarud ja heksokinaasi aktiivsus ning superoksiidi taseme tõusu ei mõõdetud.

Mehhanismi on lihtsam mõista varugeneraatori analoogia kaudu. Metüleensinine toimib alternatiivse elektronikandjana, mis võtab vastu redutseerivaid ekvivalente ja suunab need edasi tsütokroom c ning kompleksi IV poole. See toetab elektronide liikumist ja ATP sünteesi, vähendades samal ajal elektronide lekkimist ahela varasemates osades. Raske puuduse ajal on selline stimuleerimine kahjulik, sest see suurendab ainevahetuslikku vajadust olukorras, kus hapnik ja glükoos peaaegu puuduvad, ning võib viimased varud kiiremini ammendada. Pärast substraatide taastumist muutub sama omadus kasulikuks, sest aitab kahjustatud mitokondritel taastunud hapniku- ja glükoosivarustust tõhusalt kasutada. Seetõttu tuleb ka mitokondriaalset elektronide ülekannet selgitavate käsitluste tulemusi vaadelda koos puuduse tingimustega.

Üks oluline ettevaatusmärkus: see ajastusreegel kehtib just selle astrotsüütide katsemudeli kohta. Seotud rakuuuringus, kus kasutati teist rakutüüpi, leebemat puudust ja väiksemat kontsentratsiooni, leiti kaitsev mõju ka puuduse ajal manustamisel. Mõju suuna määravad rakutüüp, järelejäänud hapnik, kontsentratsioon ja katseprotokoll.

Krooniliselt vähenenud verevool: mälu, tsütokroomoksüdaas ja veresooned nädalate jooksul

Kroonilistes katsetes kasutati väikest annust iga päev nädalate vältel, mitte üht erakorralist boolusannust. Esimeses uuringus said püsivalt suletud unearteritega rotid ühe kuu jooksul iga päev 4 mg/kg. Annus anti pärast igapäevast treeningut, et mõjutada mälu kinnistumist, mitte vahetut sooritust. Suletud arteritega loomad õppisid visuaalse eristamise ülesandeid aeglasemalt ja said keerulises mälutestis kehvemaid tulemusi, samas kui ujumisvõime, motoorne aktiivsus ja lõhnade äratundmine ei muutunud. Igapäevane ravi leevendas õppimis- ja mälupuudujääke üldist motoorset käitumist muutmata.

Järeluuringus kaardistati pärast sama ühekuulist manustamisskeemi tsütokroomoksüdaasi ehk mitokondriaalse kompleksi IV aktiivsus 44 ajupiirkonnas. Arterite sulgemine vähendas ensüümi aktiivsust nägemis-, prefrontaalses ja peririnaalses ajukoores ning hipokampuses ja mandelkehas ning nõrgendas nägemiskoore ja hipokampuse vahelist koordineeritud aktiivsust. Ravi säilitas ensüümi piirkondliku aktiivsuse ja tugevdas neid piirkondadevahelisi ainevahetuslikke korrelatsioone ning säilinud aktiivsus korreleerus parema ülesandesooritusega. Need korrelatsioonid kirjeldavad ainevahetusensüümi koordineeritud aktiivsust, mitte inimese aju funktsionaalse ühenduvuse otseseid mõõtmisi. Seda eristust aitavad selgitada aju energiaainevahetuse ülevaated.

Eraldi ühenädalases uuringus kasutati iga päev 2 mg/kg ning mehhanismi uurimiseks lisati signaaliraja inhibiitor. Ravi korral suurenes aju verevool ligikaudu 60-lt ligikaudu 100 mL-ni 100 g kohta minutis ning hipokampuse veresoonte tihedus suurenes ligikaudu 15.1-lt 23 protsendini. Mõlemad suurenemised taandusid osaliselt, kui blokeeriti PI3K/Akt ellujäämissignaalirada, ning ravi korral suurenes fosforüülitud Akt tase. Verevoolu, veresoonte tiheduse, barjääri ja neuronitega seotud tulemused viitavad PI3K/Akt signaalirajaga seotud neurovaskulaarsele kaitsele, mitte puhtalt ainevahetuslikule toimele.

Miks ükski neist tulemustest ei võrdu erakorralise insuldiraviga

Laboritingimuste kontrollitus on põhjus, miks neid tulemusi ei saa otse üle kanda. Rakukultuurides puuduvad tromb ja farmakokineetika. 2VO mudel kujutab endast pikaajalist globaalset vähenenud verevoolu, mitte äkilist fokaalset embooliat koos vaid mõne minuti vanuse penumbraga. Isegi rottide MCAO mudelis kasutatakse noori terveid loomi, anesteesiat, ühesuguseid arterisulgusi ja täpselt ajastatud annustamist. See erineb eakatest patsientidest, kellel on erinevad trombid, ateroskleroos, hüpertensioon, diabeet ja teadmata sümptomite algusaeg.

Ükski avaldatud randomiseeritud inimuuring ei ole kinnitanud metüleensinist ägeda isheemilise insuldi erakorralise ravina. Mõnikord viidatud inimeste piltdiagnostika uuringus osales 26 tervet täiskasvanut, mitte insuldipatsiendid, ning üks suukaudne annus muutis ülesandega seotud ajusignaale ja parandas veidi meenutamist. See näitab toimet kesknärvisüsteemis, mitte tõhusust insuldi korral. Praegused erakorralise ravi juhised keskenduvad seevastu kiirele reperfusioonile veenisisese trombolüüsiga sobivatel patsientidel ja trombektoomiale sobivate suurte veresoonte sulguste korral ning tavapärased erakorralise insuldiravi käsitlusrajad jäävad ainsaks tõendatud lähenemiseks. Insuldikahtluse korral ei tohi abi metüleensinise manustamiseks kunagi edasi lükata ning prekliiniliste annuste ekstrapoleerimise praktilised piirangud selgitavad, miks rottide manustamisskeeme ei saa käsitada kliiniliste raviskeemidena.

Ohutusega seotud asjaolud rõhutavad seda piiri. Veenisisese metüleensinise puhul kehtib raamitud hoiatus tõsise või surmaga lõppeva serotoniinisündroomi kohta, kui seda kasutatakse koos serotonergiliste ravimitega, sealhulgas SSRI-de, SNRI-de ja MAO inhibiitoritega, mida paljud insuldiriskiga vanuses patsiendid võtavad. G6PD puudulikkuse korral on see hemolüüsiriski tõttu vastunäidustatud. Samuti pärsib see lämmastikoksiidi signaaliülekannet, mis suurendab mõnes olukorras veresoonte vastupanu ja vererõhku, mistõttu ei tohiks seda kirjeldada lihtsalt aju verevoolu suurendava ravimina. Omandatud methemoglobineemia jaoks heaks kiidetud veenisisene manustamisskeem annusega 1 mg/kg ei ole insuldiravi skeem.

Aus kokkuvõte on kitsapiiriline, kuid sisuline. Mööduva fokaalse isheemia korral vähendas reperfusiooni ajal ja selle ümber manustatud väikeses annuses metüleensinine rottidel kahjustuse arengut. Püsiva arterisulguse korral lükkas see infarkti teket edasi, kuid ei vältinud seda. Astrotsüütides oli see raske puuduse ajal kahjulik ja reoksügenatsiooni ajal kasulik. Kroonilise hüpoperfusiooni korral säilitas see nädalate jooksul tsütokroomoksüdaasi aktiivsust, veresooni ja mälu. Üks elektronide vahendaja, kolm konteksti, kolm vastust.