Metüleensinine ja hormees: miks annuse-vastuse kõverad võivad suunda muuta

Üks rott saab pärast eseme äratundmise õppimist 4 milligrammi metüleensinist kilogrammi kohta ja järgmisel päeval mäletab seda. Teine rott saab 50 ja liigutab oma jooksuratast vaevu. Molekul on sama. Mõju suund ei ole. Igaüks, kes on lugenud rohkem kui mõnda metüleensinise uuringut, on selle pöördumisega kokku puutunud. Sellel on ka nimi: hormees ehk kahefaasiline vastus, mille puhul väike ja suur kokkupuude mõjutavad sama tulemusnäitajat vastassuundades.

See nimetus on kasulik vaid siis, kui tead, mida see lubab ja mida mitte. Artiklis vaadeldakse nelja avaldatud metüleensinise andmestikku, millest igaühel on oma tulemusnäitaja, kontsentratsioonivahemik ja katsekorraldus, ning näidatakse, miks värvaine keemia muudab sellised pöördumised usutavaks. Artikkel lõpeb hoiatusega, mida andmed nõuavad: ühes katses maksimumi saavutav kõver kirjeldab seda katset, mitte ei anna meetodit isikliku annuse valimiseks.

Mustril on nimi ja selle tähendus on kitsam, kui esmapilgul paistab

Hormeesi mõiste võtsid 1943. aastal kasutusele Southam ja Ehrlich ning selle tänapäevase kvantitatiivse määratluse andsid Calabrese ja Baldwin: kohastumuslik kahefaasiline vastus, mis tekib otseselt või kompensatsiooni kaudu pärast homöostaasi häirumist. Pane tähele, mida selles määratluses ei ole. Sõna „kasulik” seal ei esine. Hormees ütleb vaid, et kõver muudab suunda, ei midagi enamat.

Kõvera kuju sõltub sellest, milline tulemusnäitaja asub vertikaalteljel. Kui näitajaks on positiivne funktsioon, näiteks ensüümi aktiivsus, hapnikutarbimine või mälutesti skoor, joonistub väikese annuse stimuleeriva ja suure annuse pärssiva toime korral ümberpööratud U. Kui näitajaks on midagi halba, näiteks haigestumus, joonistub väikese annuse pärssiva ja suure annuse võimendava toime korral J või U. Seos on sama, ordinaat erinev. Enamik metüleensinise uuringuid mõõdab positiivseid funktsioone, seega räägib see artikkel ümberpööratud U-kujulistest kõveratest, pidades silmas, et tähestikutähe kuju tuleneb graafiku koostamise valikust.

2008. aasta ülevaade, mis koondas metüleensinise hormeetilised vastused, annab suurusjärgust konkreetse pildi. Käitumise, füsioloogia ja biokeemia näitajad ulatuvad stimuleerivas vahemikus ligikaudu 130 kuni 160 protsendini kontrolltasemest, keskmiselt umbes 140 protsendini, enne kui langevad annuse edasisel suurenemisel tagasi kontrolltasemeni ja seejärel sellest allapoole. See vahemik on paljude katsete kokkuvõte, mitte molekuli omadus. Igal allpool toodud kõveral on oma maksimum oma ühikutes.

Miks just selle molekuli toime võiks pöörduda

Metüleensinine ei ole lihtsalt elektronidoonor. See on pöörduv elektronivahendaja. Oksüdeeritud sinine vorm võtab vastu elektrone ja muutub värvituks redutseeritud vormiks, mis saab need elektronid ahelas edasi anda. Nende kõverate taga olevat elektronide edasiandmist kirjeldab ülevaade sellest, kuidas metüleensinine elektrone liigutab, ning siin ongi võtmetähtsusega see vahendajaroll.

Väikestel kontsentratsioonidel pakub selline ringlus rakuhingamisele alternatiivset teed. Redutseeritud värvaine võib oksüdeeruda tsütokroomoksüdaasi ehk elektrontranspordiahela viimase ensüümi juures, suurendades selle katalüütilist käivet koos hapnikutarbimise ja rakuhingamise võimekusega. Suurematel kontsentratsioonidel hakkab sama elektrone siduv keemia tavapärast ahelat abistamise asemel sellega konkureerima: suunab elektrone nende tavapäraselt teelt kõrvale, tarbib hapnikku otse ja tekitab energia tootmise asemel reaktiivseid hapnikuühendeid. Väike kogus katalüütilist vahendajat suurendab voogu; liigne konkureeriv elektronineelaja vähendab seda. Keemia teeb suunamuutuse usutavaks, kuid ei taga midagi selle kohta, kus mõni konkreetne tulemusnäitaja maksimumi saavutab.

Sõltumatud tõendid kontsentratsioonist sõltuvuse kohta pärinevad rakkudest, millel pole üldse mitokondreid. 1976. aasta erütrotsüüdikatsetes stimuleeris väike, 1 mikromolaarne kontsentratsioon heksoosmonofosfaadi šunti mehhanismi kaudu, mis sõltus tugevalt oksühemoglobiinist. Seevastu sada korda suurema, 0.1 millimolaarse kontsentratsiooni puhul mõjutas oksühemoglobiini olemasolu tulemust vaevu ning kõigi kolme kasutatud analüüsimeetodi järgi tekkis vesinikperoksiid. Sama värvaine, kaks mehhanismi, mida eristab kontsentratsioon. Erütrotsüütides rakuhingamist ei toimu, seega ei ole see mitokondriaalne kõver. Küll aga näitab see, et värvaine redokskeemia olemus muutub kontsentratsiooni kasvades, ja just seda mitokondriaalne seletus eeldab.

Neli kõverat, neli katsekorraldust

Alloleval joonisel on neli andmestikku kõrvuti ümber joonistatud. Igal paneelil on oma teljed ja tingimused, sest nende asetamine ühele skaalale oleks esimene vale, mida see artikkel võiks esitada. Joonis on skemaatiline; täpsed väärtused ja tingimused on tekstis.

Paneel A: tsütokroomoksüdaas roti ajuhomogenaadis. Kõige selgem mitokondriaalne kõver pärineb teisest allikast: ülevaates on see joonistatud roti ajuhomogenaadi andmete põhjal. Aktiivsus on 0.5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures umbes 138 protsenti kontrolltasemest, naaseb umbes 5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures kontrolltasemele ja langeb umbes 10 mikromolaarse kontsentratsiooni juures algtasemest allapoole. Autorite oletuse järgi võtab värvaine siis elektrone ahela tavapärastelt kompleksidelt ära. Homogenaat, mikromolaarne kontsentratsioon, spektrofotomeetriline analüüs. See lause annab kogu konteksti ja väljaspool seda ei tähenda kõver midagi.

Paneel B: rottide mälu ja jooksuratta kasutamine. Rottide mälu uuringus hinnati ühekordsete treeningujärgsete süstide mõju 24 tundi hiljem. Annuste 1 kuni 10 milligrammi kilogrammi kohta korral ei erinenud liikumisaktiivsus ega söömine füsioloogilise lahuse kontrollrühmast. Seevastu 50 kuni 100 milligrammi kilogrammi kohta vähendas järsult jooksuratta kasutamist (mediaan 35 võrreldes 279 pöördega) ning suurim annus põhjustas karvade püstitõusmist, koordineerimatut liikumist ja ühe surma. Annus 4 milligrammi kilogrammi kohta parandas harjumist ja esemete äratundmist: ainet saanud rotid veetsid uudse eseme juures peaaegu 10 sekundit kauem. Aju hapnikutarbimine suurenes nii homogenaadis, mida mõjutati redutseeritud värvaine väikeste mikromolaarsete kontsentratsioonidega, kui ka ajudest võetud proovides 24 tundi pärast 1 milligrammi kilogrammi kohta manustamist in vivo. Pane tähele eristust: käitumise puhul kasutati treeningujärgseid süsteemseid annuseid, hapnikutarbimise puhul homogenaadi kontsentratsioone ja üht in vivo annust. Need on kaks katset, mitte üks kõver.

Paneel C: sebrakalade T-labürint. Sebrakalade uuringus hoiti treenitud kalu pärast treeningut 12 tundi lahustes, mille nominaalsed kontsentratsioonid olid 0.1, 0.5, 5.0 või 10.0 mikromolaari; kontrolliks kasutati sinist toiduvärvi. Parima tulemuse saavutas 0.5 mikromolaarne rühm, 5.0 rühma tulemus vastas kontrollrühmale ning 10.0 rühma tulemus oli väiksema annuse rühmadest kehvem. Selle paneeli juurde kuulub kaks mööndust. Lahuse mikromolaarne kontsentratsioon ei ole sama mis vere või aju mikromolaarne kontsentratsioon: akvaariumivee ja koe vahele jäävad aine jaotumine ja kuhjumine. Samuti on statistiline tõendus nõrgem, kui kuju lubab arvata: suure annuse rühm erines väiksema annuse rühmadest, kuid muid statistiliselt olulisi rühmadevahelisi erinevusi ei teatatud. Kõver on tegelik, kuid ligikaudne.

Paneel D: erütrotsüütide šunt. Metz ja kolleegid võrdlesid inimese erütrotsüütides 1 mikromolaarset ja 0.1 millimolaarset kontsentratsiooni õhu, süsinikmonooksiidi ning sellise gaasisegu tingimustes, mis tekitas füsioloogilise hapnikurõhu juures peaaegu täieliku karboksühemoglobiini osakaalu. Väikese annuse stimuleeriv toime langes oksühemoglobiini puudumisel järsult; suure annuse stimuleeriv toime muutus vaevu. Peroksiid tekkis ainult suure annuse korral. See paneel kuulub teiste kõrvale keemilise näitena, mitte neljanda punktina mingil üldkõveral: mitokondrid puuduvad, kontsentratsioonide erinevus on sajakordne ja gaasisegude koostist on muudetud.

Miks maksimumid ei lange kokku ega peagi langema

Neli maksimumi paiknevad homogenaadis 0.5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, treeningujärgse süsti puhul annusel 4 milligrammi kilogrammi kohta, akvaariumivees 0.5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures ning erütrotsüütides on tegu väikese ja suure kontsentratsiooni paariga, mille erinevus on sajakordne. Mistahes kahe käsitlemine sama arvuna on kategooriaviga. Igal tulemusnäitajal on oma kõver: mälu optimum ei pea kattuma oksüdaasi aktiivsuse, hapnikutarbimise, liikumisaktiivsuse ega peroksiidi tootmise optimumiga. Iga kontsentratsiooniühik tähendab midagi erinevat: homogenaadi mikromolaarne kontsentratsioon, lahuse nominaalne mikromolaarne kontsentratsioon, süsteemne annus milligrammides kilogrammi kohta ning plasma, aju ja mitokondrite kontsentratsioonid on erinevad suurused. Metüleensinise kalduvus kuhjuda mitokondritesse ja ajju hoiab neid erinevana. Iga mudel lisab oma farmakokineetika: liik, manustamisviis ja ajastus määravad, milline kude puutub kokku kui suure värvainekogusega ja kui kaua.

Siin muutub oluliseks ka annuse ja manustamisviisi roll metüleensinise ohutuses, sest neis uuringutes ilmnenud suure annuse mõjud — motoorse aktiivsuse pärssimine, koordineerimatu liikumine, üks surnud rott ja peroksiidi teke — on toksilisuse signaalid oma katsetingimustes, mitte kellegi teise ohutusvarud. Ja igaüks, kel tekib kiusatus teisendada rotile antud 4 milligrammi kilogrammi kohta inimese manustamisskeemiks, peaks kõigepealt lugema, kuidas loomkatsete tulemused suhestuvad inimestelt saadud tõenditega: lihtne liikidevaheline teisendamine milligrammides kilogrammi kohta ei ole piisav.

Viga, mida vältida

Ümberpööratud U on ahvatlev, sest see näib annuse reguleerimisnupuna, millel on märgitud ideaalne asend. Seda see ei ole. Hormees kirjeldab, mis juhtus ühe tulemusnäitajaga ühes katsekorralduses. Nelja sellise kirjelduse koondamisel saad neli maksimumi neljas ühikusüsteemis, mis on reguleerimisnupu vastand. Neid kõveraid saab ausalt kasutada võrdlemiseks ja ettevaatusele suunamiseks: eelda, et mõju võib kontsentratsiooni muutudes pöörduda, et iga tulemusnäitaja puhul toimub pöördumine oma punktis, ning suhtu umbusuga igasse väitesse, mis laenab ühe katse maksimumi, et põhjendada annust teise liigi, manustamisviisi, koe või eesmärgi puhul. Katsemustrite ja isiklike annustamisotsuste eristamine on kogu selle artikli mõte, mida siin korratakse, et see ei jääks märkamata.

Kuidas lugeda järgmist annuse-vastuse uuringut

Peaaegu iga metüleensinise kõvera juurde sobib neli küsimust. Milline tulemusnäitaja on vertikaalteljel ja kas selle pöördumine joonistaks U või J? Millist kontsentratsiooni horisontaaltelg tegelikult näitab: lahuse nominaalset kontsentratsiooni, homogenaadi, plasma või hinnangulist aju kontsentratsiooni või manustatud süsteemset annust? Milline mudel ja ajastus selle tulemuse andsid: homogenaat, rakukultuur valgustatud või pimedates tingimustes, treenitud loomad, kellele manustati ainet enne või pärast treeningut, ning millal neid testiti? Ja mis oli kontrolliks: füsioloogiline lahus, sinine toiduvärv või kandelahus, ning kas uuringu statistika toetab iga paarivõrdluse kohta esitatud väidet või ainult üldist kuju? Uuring, mis vastab kõigile neljale küsimusele, väärib sinu aega. Uuring, mis teatab maksimumi ilma nende vastusteta, on andnud sulle aadressita arvu.