Metüleensinine ja Bartonella: laborileiud ja kliinilise tõendusmaterjali piirid

Kultuurinõu ja patsiendi puhul kasutatakse sama sõna — infektsioon —, kuid see ei tähista sama nähtust. Nõus tähendab infektsioon agaril kasvavate kolooniate arvu. Patsiendi puhul tähendab see rakkudes ja veresoontes olevaid baktereid, veres ja kudedes liikuvaid ravimeid ning immuunsüsteemi, mis teeb osa tööst. Kui need kaks segamini ajada, hakkab muljetavaldav laboritulemus paistma ravimeetodina. Kui neid lahus hoida, jääb sama tulemus selleks, mis see tegelikult on: põhjuseks teha järgmine katse.

Selle eristuse hoidmine ongi käesoleva metüleensinist ja Bartonella't käsitleva ülevaate eesmärk. Ühe uurimisrühma kaks laboriuuringut katsetasid metüleensinist Bartonella henselae vastu seisundites, kus bakterid ei kasva. Mõlemad kirjeldasid tugevat toimet klaas- ja plastnõudes. Kumbki ei hõlmanud katseid inimestel.

Miks uurijad katsetavad statsionaarset kasvufaasi

Enamik antibiootikumide katseid kasutab kasvavaid rakke. Selline mudel jätab tähelepanuta keerulisema olukorra: rakud, mis on lõpetanud jagunemise ja taluvad ravimeid, mis hävitavad nende kasvavaid liigikaaslasi.

Bartonella võib organismis püsima jääda, sealhulgas erütrotsüütides ja endoteelirakkudes. Seetõttu uuris töörühm, millised heakskiidetud ravimid suudavad hävitada B. henselae pärast selle jõudmist statsionaarsesse kasvufaasi. Madal MIC kasvavate rakkude puhul ei ennustanud statsionaarses faasis rakkude hävitamist. Rifampitsiini MIC oli väga madal, kuid see hävitas statsionaarses faasis rakke halvasti, samas kui suurema MIC-väärtusega ühendid hävitasid neid hästi. Lugejad, kes soovivad üldist meetodit seda tüüpi artiklite hindamiseks, leiavad selle metüleensinise uuringute lugemise juhendist.

Esimene sõeluuring: Li ja kolleegid, 2019

Ajakirjas Antibiotics avaldatud 2019. aasta statsionaarse kasvufaasi sõeluuringus kasutati üht tüve, B. henselae JK53, mida kasvatati Schneideri söötmes 10 protsendi veiseloote seerumiga temperatuuril 37 C ja 5 protsendi CO2 juures. Ühepäevased kultuurid koosnesid peamiselt hajusalt paiknevatest jagunevatest rakkudest. Viiepäevaseid kultuure, milles oli ligikaudu 10 astmes 8 kolooniat moodustavat ühikut mL kohta, käsitleti statsionaarses kasvufaasis kultuuridena ning need sisaldasid nähtavaid agregaate.

Analüüsis kasutati SYBR Green I ja propiidiumjodiidi ning meetod kalibreeriti elusate ja isopropanooliga surmatud rakkude segude abil. Kuna metüleensinine on tugeva värvusega, kinnitati esialgsed positiivsed leiud mikroskoopiaga ja seejärel kolooniate loendamisega vereagaril, mis oli rangem hindamiskriteerium.

1,581 heakskiidetud ravimi katsetamisel kontsentratsioonil 50 mikromolaari jäi metüleensinise puhul eluvõimeks plaadilugeja järgi 16 protsenti ja mikroskoopia järgi 25 protsenti. Daptomütsiini tulemus oli 21 protsenti, mitmel asoolil 22 kuni 27 protsenti, gentamütsiinil 32 protsenti, erütromütsiinil 66 protsenti ja tsiprofloksatsiinil 74 protsenti. Pürviiniumpamoaat paistis plaadilugeja põhjal tugevama toimega, kuid selle enda fluorestsentsi tõttu ei saanud seda mikroskoopiaga hinnata.

Kasvava B. henselae puhul oli metüleensinise MIC 0.08 kuni 0.16 mikrogrammi mL kohta. Viiepäevaste statsionaarses faasis rakkude puhul kontsentratsioonil 5 mikrogrammi mL kohta langes kolooniate arv pärast ühepäevast kokkupuudet tasemeni, kus kolooniaid enam ei tuvastatud; sama tulemus saadi daptomütsiini ja pürviiniumpamoaadi katsetatud kontsentratsioonidel. Eraldi ajast sõltuva bakterite hävimise katses kasutati kontsentratsiooni 10 mikrogrammi mL kohta. Need on laboratoorse kokkupuute kontsentratsioonid, mitte annused, ning artiklis on need ka sellisena esitatud. Artiklis viidatud inimese maksimaalne plasmakontsentratsioon ligikaudu 3.9 mikrogrammi mL kohta on toodud üksnes taustainfona. Metüleensinise farmakokineetika ülevaade selgitab, miks plasmakontsentratsiooni ei saa tõlgendada koekontsentratsioonina.

Artiklis on sõnaselgelt välja toodud kaks piirangut. Biokile mudelit ei kasutatud ja metüleensinise kombinatsioone ei katsetatud. Viiepäevased agregaadid olid rakukogumikud statsionaarses vedelkultuuris, mitte valideeritud biokilekatse. Autorid kutsusid üles tegema loomkatseid, kombinatsioonide katseid ja biokilekatseid ning uurima teisi Bartonella liike.

Kombinatsioonid ja biokilest pärinevad rakud: Zheng ja kolleegid, 2020

Ajakirjas BMC Microbiology avaldatud 2020. aasta jätku-uuringus kasutati sama tüve ja söödet, kuid mindi üle kuuepäevastele statsionaarsetele kultuuridele ning lisati kaks asja, mis esimeses artiklis puudusid: kahe ravimi kombinatsioonid ja biokilest pärinevate rakkude mudel.

Üksikravimite katsetamisel ühtsel kontsentratsioonil 5 mikrogrammi mL kohta 24 tunni jooksul jäi metüleensinise puhul alles 3.2 korda 10 astmes 4 kolooniat moodustavat ühikut mL kohta, võrreldes kontrollrühma ligikaudu 2.8 korda 10 astmes 10 ühikuga. Tsiprofloksatsiini, gentamütsiini ja nitrofurantoiini puhul jäi samal ajahetkel alles vähem kolooniaid. See erineb 2019. aasta tulemusest, kus sama nimikontsentratsiooni juures ei tuvastatud pärast ühte päeva ühtegi kolooniat. Kultuuri vanus, tihedus ja käsitlemine olid erinevad, seega oli bakterite hävitav toime korratav suuna poolest, kuid mitte ulatuselt identne. Selline katsete vaheline erinevus on üks põhjus, miks tavapärastes ohutuse ja koostoimete kontrollides käsitletakse laboratoorset toimet kliinilisest mõjust eraldi.

Kombinatsioonide sõeluuring on kõige sagedamini tsiteeritud osa. Iga komponendi kontsentratsioon oli fikseeritud tasemele 5 mikrogrammi mL kohta. Nii asitromütsiini ja metüleensinise kui ka rifampitsiini ja metüleensinise kombinatsiooni puhul ei tuvastatud 24 tunni möödudes statsionaarse kasvufaasi kolooniaid. Sama tulemus saadi mõlema tsiprofloksatsiini sisaldava kombinatsiooniga ning 25 katsetatud paarist ainult nende neljaga. Formaalset sünergiaanalüüsi ei tehtud, seega on õige nimetus nendes tingimustes toimiv kombinatsioon, mitte tõendatud sünergia.

Biokilekatses uuriti noorest lõhutud biokilest eraldatud rakke, mitte ravimi tungimist terviklikku küpsesse biokilesse. Kultuure kasvatati viis päeva, lahjendati süvendplaatidele veel viieks päevaks, biokile olemasolu kinnitati kristallvioletiga värvimise abil ning seejärel kraabiti rakud enne ravimitega kokkupuudet lahti. Kontsentratsioonil 5 mikrogrammi mL kohta langes metüleensinise ainsa ainena kasutamisel kolooniate arv 6. päevaks tasemele 2.3 korda 10 astmes 2, mis oli üks parimaid üksikainete tulemusi, kuid mitte null. Mõlemad metüleensinise kombinatsioonid jõudsid 6. päevaks nullini, nagu ka mõlemad tsiprofloksatsiini kombinatsioonid.

Autorid tõid välja samad piirangud, mida märkaks tähelepanelik lugeja: noor lahtikraabitud biokile vana tervikliku biokile asemel; üks mugav kontsentratsioon kõigi ravimite jaoks, selle asemel et kasutada iga ravimit selle enda realistlikul tippkontsentratsioonil; ainult valitud paarid, mille üks komponent oli asitromütsiin või rifampitsiin; üks tüvi; puudusid loomkatsed ja patsiendid. Hilisem kolme ravimi kombinatsioonide uurimine pakuti välja, kuid tulemusi ei esitatud.

Uuringukavade võrdlus

Tabel esitab selle artikli põhisõnumi kokkuvõtlikult. Kõik viimasest veerust vasakul on kultuuridega tehtud töö. Kummaski artiklis ei ole midagi, mis kuuluks viimasesse veergu.

Bartonella ei ole Borrelia

Mõlemad artiklid mainivad Borrelia burgdorferi't, Lyme'i tõbe põhjustavat spiroheeti, sest värvainetel põhinev analüüs pärines sama labori varasematest Borrelia statsionaarse kasvufaasi uuringutest, kus ka metüleensinine ja daptomütsiin olid osutunud toimivateks aineteks. See taust on kasulik, kuid ka sage eksimuste allikas.

Kummaski Bartonella artiklis ei ole katset, milles uuritaks Borrelia't ja Bartonella't kõrvuti. Organismid, söötmed ja kontsentratsioonid on erinevad ning metüleensinise oletatav mõju Bartonella membraanile esitati oletusena, mis vajab täiendavat uurimist. Tulemusi ei tohiks ühelt liigilt teisele üle kanda ning kumbki artikkel ei toeta üldisi väiteid parasiitide kohta. Just sel põhjusel hoiab Borrelia ja Bartonella püsirakkude võrdlus need kaks uurimissuunda lahus.

Miks kultuuritulemustest ei saa raviprotokolli

Otsinguhuvi metüleensinise ja Bartonella raviprotokolli vastu on mõistetav. Need artiklid näitavad, miks seda väljendit tuleks käsitleda hoiatusmärgina, mitte ostunimekirjana.

Esiteks ei ole 5 mikrogrammi mL kohta süvendis ravijuhis. Selle juurde ei kuulu andmeid imendumise, jaotumise, valkudega seondumise, rakusisese tungimise ega talutavuse kohta. Autorid valisid selle antibiootikumide tippkontsentratsioonide ligikaudse keskmisena ja märkisid, et tulevastes uuringutes tuleks kasutada iga ravimit selle enda realistlikul kontsentratsioonil.

Teiseks tähendab null kolooniat seda, et nendes külvitingimustes kolooniaid ei tekkinud, mitte seda, et kude oleks steriilne. Püsirakud, rakusisesed bakterid ja proovivõtu piirangud jäävad kõik agariplaadist väljapoole.

Kolmandaks võivad süvendi steriliseerivad kombinatsioonid organismis ebaõnnestuda või kahju tekitada. Asitromütsiini ja metüleensinise ning rifampitsiini ja metüleensinise kombinatsioonid on laboratoorsed paarid laboratoorsetel kokkupuutetasemetel. Ilma loomade farmakokineetika andmete ja kontrollitud inimuuringuteta ei ole määratud annust, kestust ega kasu ja riski suhet. Igaüks, kes kaalub võimalusi, peaks neid arutama arstiga ning tutvuma sellega, millal metüleensinise kasutamine vajab meditsiinilist järelevalvet, enne kui teeb kultuurinõu andmetest järeldusi.

Kitsas järeldus, mida need artiklid toetavad, on järgmine: metüleensinisel on in vitro korratav toime mittekasvava B. henselae JK53 vastu, sealhulgas kahe ravimi laboratoorsetes kombinatsioonides, kusjuures tugevaimad kombinatsioonide ja biokilest pärinevate rakkude tulemused saadi 2020. aasta uuringus. Kõik muu, sealhulgas see, kas selline toime on inimese bartonelloosi puhul oluline, on endiselt uurimata.