Metüleensinine ja ATP: kas suurem hapnikutarbimine tähendab rohkem energiat?

Isoleeritud mitokonder asub kambris, kus on energiaallikas, kuid puudub ADP. See tarbib hapnikku aeglaselt. ADP lisamisel suureneb hapnikutarbimine mitu korda. Kui ADP saab otsa, langeb hapnikutarbimine taas. Energiaallikas ei muutunud kordagi. Muutus ainult vajadus ATP järele.

See väike sündmuste jada võtab kokku kogu eristuse, millest see artikkel räägib. Hapnikutarbimine mõõdab, kui kiiresti liiguvad elektronid mööda hingamisahelat hapnikuni. ATP tootmine mõõdab, kui suur osa sellest voost talletatakse kasutatava energiana. Neid ühendab üks vaheetapp: prootonigradient mitokondri sisemembraanil. Kõik, mis muudab gradiendi ja ATP sünteesi vahelise sidestuse tugevust, võib viia need kaks lõppnäitajat eri suundades. Metüleensinine on siin hea õpetaja, sest selle puhul on täheldatud mõlemat: mõnes preparaadis suureneb hapnikutarbimine koos ATP-ga, teistes suureneb hapnikutarbimine, samal ajal kui ATP hulk jääb samaks või väheneb.

Lugejad, kes soovivad esmalt laiemat pilti elektronide vahendamisest, võivad alustada sellest, kuidas metüleensinine kannab elektrone läbi hingamisahela. Need, kes soovivad mõista varajaste hapnikukatsete sõnavara, võivad lugeda, mida esimesed hingamismõõtmised tegelikult näitasid.

Hingamine, ATP ja nendevaheline gradient

NADH ja FADH2 elektronid sisenevad ahelasse komplekside I ja II kaudu, liiguvad läbi kompleksi III tsütokroom c-ni ning seejärel läbi kompleksi IV hapnikuni. Kompleksides I, III ja IV vabanev energia pumpab prootoneid maatriksist membraanidevahelisse ruumi. See laengu ja happesuse eraldatus tekitab prootonmotoorse jõu, mille elektriline komponent ehk membraanipotentsiaal on tavaliselt valdav osa.

ATP süntaas laseb prootonitel tagasi maatriksisse voolata ning kasutab vabanevat energiat ADP ja fosfaadi ühendamiseks ATP-ks. Seega on ahel järgmine:

hapnikutarbimine, seejärel prootonite pumpamine, seejärel gradient, seejärel ATP süntees.

Asja teeb keerulisemaks see, et prootonid võivad tagasi liikuda ka teisi teid pidi. Igasugune tagasivool, mis möödub ATP süntaasist, on prootonileke. Leke sunnib ahelat samu prootoneid uuesti välja pumpama, et hoida membraanipotentsiaali stabiilsena. Nii kulub rohkem hapnikku, kuid ATP-d ei teki juurde. Piisavalt tugev leke tähendab lahtisidestust: hapnikutarbimine suureneb, samal ajal kui ATP hulk jääb samaks või väheneb, ning raisatud energia eraldub soojusena.

Olek 3, olek 4 ja hingamiskontrolli suhe

Selle klassikaline sõnavara pärineb isoleeritud mitokondrite uuringutest. Olek 3 tähistab hingamist substraadi ja ADP juuresolekul: ATP süntaas vähendab gradienti, membraanipotentsiaal langeb, ahel kiireneb selle taastamiseks ning hapnikutarbimine on suur, sest toodetakse ATP-d. Olek 4 tähistab hingamist pärast ADP lõppemist: ATP süntaas jääb jõude, gradient suureneb, kõrge membraanipotentsiaal takistab edasist pumpamist ning hapnikutarbimine langeb tasemele, mida on vaja lekke korvamiseks.

Hingamiskontrolli suhe ehk oleku 3 hingamiskiirus jagatuna oleku 4 hingamiskiirusega näitab seega, kui tihedalt on preparaadis hingamine ja ATP süntees sidestatud. Kõrge suhe tähendab, et ADP kontrollib hingamist tugevalt. Suhte langus koos oleku 4 hingamiskiiruse suurenemisega tähendab, et leke hakkab domineerima. Selle vaatenurga kaudu muutuvad allpool toodud metüleensinise tulemused arusaadavaks.

Üht mõttemudelit tasub meeles pidada. Kõrge membraanipotentsiaal aeglustab ahelat. Potentsiaali hajumine kiirendab seda. Ahel reageerib sellele, kui raskeks on pumpamine muutunud, mitte otseselt sellele, kas ATP-d toodetakse.

Kui lõppnäitajad muutuvad koos

Kõige selgem näide sidestatud muutusest pärineb blokeeritud hingamisahela kompleksidega isoleeritud merisea aju mitokondritest. Metüleensinise kontsentratsioonidel 100 nanomolaarsest kuni 1 mikromolaarseni suurenes puhkeoleku hapnikutarbimine, kui energiaallikaks oli glutamaat koos malaadiga, suktsinaat või glütserofosfaat, samal ajal kui ADP-ga stimuleeritud hingamine ei muutunud. Mitokondrites, mille kompleks I või kompleks III oli mürgiga pärsitud, suurendas värvaine mõõdukalt ATP tootmist, taastas membraanipotentsiaali ja parandas kaltsiumi omastamist. Pakutud mehhanism on otsetee: värvaine võtab elektronid vastu enne blokeeritud kohta ja annab need tsütokroom c-le, möödudes kahjustatud kompleksist.

Teine koosmuutumise näide kasutab täiesti teistsugust ATP allikat. Isoleeritud aju mitokondrites, mille ATP süntaas oli pärsitud, stimuleeris metüleensinine endiselt hingamist kõigi katsetatud substraatide korral. ATP süntees suurenes aga ainult alfa-ketoglutaraadi ja glutamaadi korral: need kaks substraati moodustavad suktsinüül-CoA-d. Kui oligomütsiin blokeeris ATP süntaasi, tekkis lisanduv ATP sidrunhappetsüklis suktsinüül-CoA ligaasi vahendatud substraaditasemel fosforüülimisest, mitte oksüdatiivsest fosforüülimisest. Värvaine taastas ka membraanipotentsiaali, kui kompleks I ja ATP süntaas olid korraga pärsitud. Siin muutusid hapnikutarbimine ja ATP koos, kuid ainult siis, kui substraat võimaldas teist ATP tootmise rada. Suktsinaadi või malaadi korral suurenes hingamine ilma täiendava ATP-ta. Sama värvaine, sama kamber, teine energiaallikas, teine vastus.

Kui lõppnäitajad lahknevad

Lahknemist näitavad juhtumid on samuti avaldatud ja sama õpetlikud. 1997. aasta isoleeritud roti maksa mitokondrite uuringus kiirendas metüleensinine oleku 4 hingamist tihedalt sidestatud, suktsinaati kasutavates mitokondrites, mistõttu hingamiskontrolli suhe langes. Mõju oli nähtav alates 0.5 mikromolaarsest kontsentratsioonist ja tugev 5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, mis on lähedane plasmatasemele pärast 100-milligrammist intravenoosset boolust. 5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures mitokondrid ka paisusid, kuid sidestuse häire ilmnes esmalt väiksematel kontsentratsioonidel. See viitab, et leke eelnes struktuurikahjustusele, mitte ei tekkinud selle tagajärjel. Lahtisidestatud mitokondrites stimuleeris värvaine hingamist kontsentratsioonist sõltuval ja küllastuval viisil. Hapnikutarbimine suurenes mõlemas preparaadis. ATP süntees tarbitud hapniku kohta ei suurenenud. See on õpikunäide lahtisidestusest koos elektronide vahendamisega ühes ja samas molekulis.

Kõige ilmekam lahknemine ilmneb võrkkestas. AIF-puudulikkusega hiirtel ja rotenooniga töödeldud fotoretseptorirakkudes säilitas metüleensinine võrkkesta paksuse, fotoretseptorite markerid ja mitokondrite struktuuri. Samuti vähendas see NADH ja NAD suhet ning nõrgendas stressiradade aktiivsust, sealhulgas voltumata valkude vastust ja mitofaagiat. Seda kõike ilma ATP puudujääki kõrvaldamata. Kaitse ilma energiatootmise taastumiseta tähendab, et kasu tulenes redokstasakaalust ja mitokondrite terviklikkusest, mitte täiendavast ATP-st. Igaüks, kes samastaks koe säilimise energiatootmise taastumisega, tõlgendaks seda katset täiesti valesti.

Aju mitokondrite uuring lisab samasse arvestusse ka kulude veeru. Samad väikesed kontsentratsioonid, mis parandasid bioenergeetikat, suurendasid kõigis katsetatud tingimustes ka vesinikperoksiidi teket ja aeglustasid selle kõrvaldamist. Seda mõõdeti kalibreeritud Amplexi analüüsiga, mitte mittespetsiifilise värvainega. Rohkem ATP-d ja rohkem oksüdanti tulid paarina.

Praktiline kontrollnimekiri lugemiseks

Neli küsimust aitavad eristada sidestatud tulemust lahtisidestatud tulemusest.

Esiteks: millist lõppnäitajat tegelikult mõõdeti? Hapnikutarbimine üksi ei näita ATP-d. ATP süntees, membraanipotentsiaal ja hingamiskontrolli suhe lisavad igaüks ühe infokillu, mida hapnikuelektrood ei näe. Metüleensinise teadusuuringute väidete lugemise juhend käsitleb seda lõppnäitajate eristamist üksikasjalikult.

Teiseks: millise substraadiga mitokondreid varustati? Suktsinüül-CoA tulemus näitab, et energiaallika valik võib otsustada, kas täiendav hingamine saab üldse anda täiendavat ATP-d.

Kolmandaks: millist kontsentratsiooni kasutati? Nanomolaarsest kuni väikese mikromolaarse kontsentratsioonini andis metüleensinine aju mitokondrites mõõduka bioenergeetilise paranemise oksüdandi tekkega kaasneva hinnaga; poole mikromolaarsest kontsentratsioonist alates nõrgenes maksa mitokondrites sidestus; 5 mikromolaarse kontsentratsiooni juures lisandus paisumine. Kontsentratsioon on osa mehhanismist, mitte taustadetail.

Neljandaks: millises mudelis tulemus saadi? Isoleeritud mitokondrid paljastavad süsteemi toimimise, kuid terviklikes rakkudes ja kudedes lisanduvad transport, redutseerumine värvituks vormiks ning konkureerivad elektronide vastuvõtjad. Laboratoorsed annustamisuuringud, sealhulgas see, kuidas kontsentratsioon ja protokoll kujundavad metüleensinise toimet, on sillaks katsekambri arvude ja mis tahes inimest puudutava väite vahel.

Hapnikutarbimine näitab elektronide voogu. ATP näitab, kui suur osa sellest voost talletati. Metüleensinine võib muuta kumbagi ning eespool kirjeldatud katsed näitavad kõiki nelja sellest tulenevat kombinatsiooni: mõlemad suurenevad; hingamine suureneb koos ATP-ga ainult seal, kus substraat seda võimaldab; hingamine suureneb, samal ajal kui sidestus nõrgeneb; ning kude säilib, samal ajal kui ATP hulk jääb samaks. Hapnikuelektroodi näit on tõlgendamise algus, mitte lõpp.