EMB agar versus MacConkey agar: söötme valik ja tõlgendamine

Üliõpilane külvab sama veeproovi kahele plaadile. Ühel ilmuvad tumedad rohelise metalse läikega kolooniad. Teisel ilmuvad erkroosad kolooniad häguse haloga. Mõlemad plaadid inokuleeriti samast katsutist, inkubeeriti kõrvuti ja loeti samal tunnil. Üliõpilane küsib, kumb plaat on õige.

Mõlemad plaadid on õiged. Need vastavad erinevatele küsimustele. Segadus tekib siis, kui neid kahte söödet käsitletakse vahetatavate sõeltestidena soolebakterite jaoks. Neil on ühine eesmärk: selekteerida Gram-negatiivseid enteraalseid organisme ning eristada laktoosi fermenteerijaid mittefermenteerijatest, kuid nad saavutavad selle erineva keemia ja erineva visuaalse loogika abil. Kui mõista neid kahte põhimõtet, muutuvad nii söötme valik kui ka kolooniate hindamine rutiinseks.

Lühivastus

EMB agar kasutab kahte värvainet, eosiin Y-d ja metüleensinist, millel on kaks ülesannet: need pärsivad Gram-positiivsete kasvu ja sadestuvad tugevate happetootjate ümber, tekitades tumedad kolooniad ning klassikalisel juhul Escherichia coli korral metallrohelise läike. MacConkey agar eraldab need ülesanded: sapisoolad koos kristallvioletiga pärsivad Gram-positiivseid, laktoos toimib fermentatsiooni substraadina ning neutraalpunane näitab happe teket roosade või punaste kolooniatena. Kui eesmärk on E. coli silmatorkav presumptiivne demonstreerimine, on EMB sobiv valik. Kui eesmärk on laktoosi fermenteerijate kiire ja selge jaotamine roosadeks ning mittefermenteerijate eristamine värvitutena, eriti väljaheite- või uriiniproovide töövoogudes, on MacConkey tavaliselt lihtsamini loetav. Kumbki plaat ei tuvasta organismi üksnes värvi põhjal.

EMB: värvained, mis korraga selekteerivad ja näitavad tulemust

EMB põhimõttes täidavad samad molekulid nii selektsiooni kui ka indikaatori rolli. ASM-i eosiin-metüleensinise agari protokoll kirjeldab EMB-d nii selektiivse kui ka diferentsiaalse söötmena, kus värvainete paar pärsib paljusid Gram-positiivseid organisme ning laktoosi fermentatsioon soodustab värvainete seondumist ja sadestumist. Standardne Levine'i koostis sisaldab peptooni, laktoosi, fosfaati, eosiin Y-d, metüleensinist ja agarit, nagu on loetletud FDA BAM-i Levine'i EMB agari meetodis. Arvestage, et mõnes vanemas EMB retseptis lisati laktoosi kõrval ka sahharoosi, samas kui Levine'i EMB sisaldab laktoosi ilma sahharoosita, seega dokumenteerige, millist koostist teie laboris kasutatakse.

EMB lugemine tähendab värvainete käitumise hindamist. Intensiivne laktoosi fermentatsioon tekitab piisavalt hapet, et põhjustada ulatuslikku värvainete sadestumist, mille tulemusena on E. coli kolooniatel tumesinised kuni mustad keskosad ja klassikalisel juhul peegeldunud valguses metallroheline läige. Nõrgemad fermenteerijad, näiteks Enterobacter ja Klebsiella, kasvavad tavaliselt roosade kuni lillakate limaste kolooniatena ilma sellise läiketa. Mittefermenteerijad, nagu Salmonella, Shigella ja Proteus, kasvavad üldiselt värvitute või poolläbipaistvate kolooniatena, sest nad ei tekita värvainete sadestamiseks vajalikku järsku happesuse suurenemist. Gram-positiivsed on tavaliselt pärsitud, kuigi pärssimine on astmeline ning sõltub tüvest ja tootest. Värvainete valmistamise üksikasjalik keemia, sealhulgas põhjus, miks metüleensinine toimib katioonse värvina, kuulub eraldi värvainete koostisi käsitlevasse arutellu, ning üldisem mikroskoopiakontekst on esitatud värvimismeetodite atlases. Käesolev artikkel keskendub söötme valikule ja plaatide lugemisele.

Ülaltoodud joonis on illustratiivne. See näitab oodatavat visuaalset loogikat: EMB-l tumedad läikivad kolooniad, roosad limased tüübid ja kahvatud tüübid, MacConkeyl aga roosad võrrelduna kahvatute tüüpidega. Kasutage seda mustri õppimiseks ning seejärel kinnitage iga hinnang fotodega kontrollkultuuride ja teie töölaual oleva täpse söötme tootjajuhendi põhjal.

MacConkey: eraldatud ülesanded, lihtsam visuaalne reegel

MacConkey põhimõttes täidab iga koostisosa eraldi ülesannet. ASM-i MacConkey agari protokoll kasutab sama selektiivse ja diferentsiaalse söötme käsitlust ning FDA BAM-i MacConkey agari meetod loetleb põhikomponendid: peptoonid, laktoos, sapisoolad, sool, neutraalpunane, kristallviolett ja agar. Sapisoolad koos kristallvioletiga selekteerivad Gram-positiivsete vastu. Laktoos annab fermentatsioonisubstraadi. Neutraalpunane toimib pH-indikaatorina ning muutub happe tekkekohas roosaks kuni punaseks; tugevate fermenteerijate ümber võib mõnikord esineda ka sadestunud sappi.

Lugemisreegel on teadlikult lihtne: roosa tähendab laktoosi fermenteerijat, värvitu või kahvatu tähendab mittefermenteerijat. E. coli on roosa kuni punane, sageli sapisademe haloga. Klebsiella ja Enterobacter on roosad ning kapslite tõttu sageli limased. Salmonella, Shigella, Proteus ja paljud teised Gram-negatiivsed pulkbakterid on värvitud. Õppelaborites on oluline ka kõrvaleelis: sapisoolad vähendavad üldiselt Proteus'e sülemlemist, mistõttu on MacConkey agaril isoleeritud kolooniaid lihtsam saada kui mitteselektiivsel söötmel, kuigi pärssimine ei ole absoluutne ning olukordades, kus sülemlemise kontroll on esmatähtis, on olemas soolavabad alternatiivid.

Molekulaarne põhjus, miks värvained nii käituvad, tuleneb laengust ja struktuurist. Metüleensinine on katioonne fenotiasiinvärv, mille struktuur ja omadused selgitavad selle afiinsust bakterite happeliste pindade suhtes; sama afiinsus toimib ka siis, kui värvaine EMB happelistes tsoonides sadestub.

Võrdlus lühidalt

Käsitlege tabelit otsustusjuhisena. Kui harjutuse eesmärk on näidata õpilastele fermentatsiooni tugevuse astmestikku koos ühe silmatorkava lõpptulemusega, näitab seda EMB. Kui eesmärk on kiire binaarne jaotus enne biokeemilist kinnitamist, näitab seda MacConkey.

Milline sööde millise proovi jaoks

Veeproovide harjutustes, mille eesmärk on fekaalsete koliformide või E. coli presumptiivne tuvastamine, on EMB atraktiivne, sest läige on visuaalselt hästi eristatav. MacConkey sobib samuti enteraalsete Gram-negatiivsete organismide jaoks ja seda on ajalooliselt kasutatud veeanalüüsis, kuid kumbki plaat ei asenda regulatiivset veemeetodit, mis võib olenevalt testist ette näha selliseid söötmeid nagu modifitseeritud mTEC või MI. Kontrollige meetodit, mida teie labor peab järgima.

Väljaheiteproovi laadsel fermenteerijate ja mittefermenteerijate eristamisel on MacConkey neist kahest üldiselt kasulikum. Praktilises väljaheiteanalüüsis Salmonella või Shigella suhtes lisatakse tavaliselt selektiivsemad enteraalsed söötmed, näiteks XLD või Hektoen enteric, selle asemel et tugineda üksnes MacConkeyle.

Uriiniproovi laadseks õppeks, mis jäljendab kliinilist töövoogu, kasutage MacConkey agarit koos vereagariga. MacConkey võimaldab varajast Gram-negatiivsete eristamist, samal ajal kui vereagar võimaldab kasvada organismidel, mida MacConkey pärsib. Seda paari kirjeldatakse kliinilistes uriinikülvi töövoogudes standardsena.

Puhtalt põhimõtete õpetamiseks kasutage mõlemat. EMB näitab, et fermentatsiooni tugevus on oluline ja et üks molekul võib täita kahte rolli. MacConkey õpetab modulaarset ülesehitust: selektor, substraat ja indikaator on eraldi. Õpilased, kes külvavad teadaoleva E. coli, teadaoleva Klebsiella aerogenes'e ja teadaoleva Salmonella kõrvuti mõlemale söötmele, ajavad nende kahe süsteemi loogika harva uuesti segamini.

Tõlgendamisvead, mis korduvad igal semestril

Kõige tavalisem viga on organismi tuvastamine üksnes värvi järgi. Roosa koloonia MacConkeyl võib olla E. coli, Klebsiella, Enterobacter või mõni muu fermenteerija. Värvitu võib olla Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas või mõni muu mittefermenteerija. Värvus on sõelumisfenotüüp, mis suunab kinnitavaid uuringuid, näiteks Gram-värvingut, oksüdaasitesti, biokeemilisi paneele või instrumentaalset identifitseerimist; see ei ole liiginimi.

Teine viga on puuduva läike ületõlgendamine. Mõned tegelikud E. coli kolooniad, eriti isoleeritud kolooniad, annavad EMB-l vähe või üldse mitte metallilist läiget. Läike puudumine ei välista E. coli't ja läike olemasolu ei tõesta seda. Käsitlege läiget presumptiivse vihjena.

Kolmas viga on eri vanusega plaatide võrdlemine. Hilised laktoosi fermenteerijad võivad pikema inkubatsiooni järel MacConkeyl roosaks muutuda, mis hägustab selget fermenteerijate ja mittefermenteerijate jaotust. Lugege plaate laboris ette nähtud tunnil ja dokumenteerige tulemusega koos inkubatsiooniaeg.

Neljas viga on segakasvu käsitlemine ühe organismina. Roosa koloonia värvitu koloonia kõrval tähendab kahte fenotüüpi, mitte vahepealset tulemust. Valige hästi isoleeritud kolooniad ja töötage iga morfotüübiga eraldi. Limane tekstuur tekitab sarnase lõksu: nii Klebsiella kui ka Enterobacter võivad näida limased, seega ei määra kapsel üksi organismi nimetust. Organism, mida varem õpetati nimega Enterobacter aerogenes, klassifitseeritakse nüüd kui Klebsiella aerogenes, mis selgitab, miks vanemad tabelid ja uuemad nimetused näivad omavahel vastuolus olevat.

Kontrollid ja lõpetav reegel

Kasutage igal seansil fotodega või värskeid kontrolle: E. coli tugeva fermentatsioonireaktsiooni jaoks, Klebsiella aerogenes limase fermentatsiooni jaoks ilma klassikalise läiketa, Salmonella tüvi värvitu mittefermenteerija reaktsiooni jaoks ning Staphylococcus aureus Gram-positiivsete pärssimise kinnitamiseks teie kasutataval konkreetsel tootel. Sobitage tüvenumbrid ja aktsepteerimiskriteeriumid tootja juhendiga, sest selektiivsus muutub sõltuvalt sapi, kristallvioleti ja värvainete sisaldusest.

Pidage töölaua juures meeles üht lauset. EMB kasutab värvaineid, mis korraga selekteerivad ja annavad visuaalse signaali, pakkudes silmatorkavat E. coli reaktsiooni keerukama tõlgendamise hinnaga. MacConkey eraldab selekteerimise ja signaali andmise, pakkudes lihtsat roosa ja kahvatu jaotust väiksema fermentatsioonidetaili hinnaga. Valige sööde, mille põhimõte vastab küsimusele, kinnitage värv sobivate testidega ning need kaks plaati lakkavad omavahel konkureerimast ja hakkavad üksteist täiendama.