Glas methylen ac ATP: a yw mwy o ddefnydd o ocsigen yn golygu mwy o egni?

Mae mitocondrion wedi'i ynysu mewn siambr gyda thanwydd ond heb ADP. Mae'n defnyddio ocsigen yn araf. Ychwanegwch ADP ac mae'r defnydd o ocsigen yn neidio sawl gwaith yn uwch. Arhoswch nes bod yr ADP wedi'i ddefnyddio i gyd ac mae'r defnydd o ocsigen yn gostwng eto. Ni newidiodd y tanwydd o gwbl. Dim ond y galw am ATP a newidiodd.

Mae'r dilyniant bach hwnnw'n cynnwys y gwahaniaeth cyfan y mae'r erthygl hon yn ei drafod. Mae defnydd o ocsigen yn mesur pa mor gyflym mae electronau'n llifo drwy'r gadwyn resbiradol i ocsigen. Mae cynhyrchu ATP yn mesur faint o'r llif hwnnw sy'n cael ei gipio fel egni defnyddiadwy. Mae'r ddau'n rhannu cam canol, sef y graddiant protonau ar draws pilen fewnol y mitocondrion, a gall unrhyw beth sy'n newid pa mor dynn y mae'r graddiant wedi'i gyplu â synthesis ATP symud y ddau fesur terfynol i gyfeiriadau gwahanol. Mae glas methylen yn enghraifft ddefnyddiol yma oherwydd gwelwyd ef yn gwneud y ddau: cynyddu defnydd o ocsigen ochr yn ochr ag ATP mewn rhai paratoadau, a chynyddu defnydd o ocsigen tra bo ATP yn aros yn gyson neu'n gostwng mewn eraill.

Gall darllenwyr sydd am ddeall y darlun ehangach o'r trosglwyddo yn gyntaf ddechrau gyda sut mae glas methylen yn cludo electronau drwy'r gadwyn resbiradol, a gall darllenwyr sydd am ddeall geirfa'r arbrofion ocsigen cynnar ddarllen beth a ddangosodd y mesuriadau resbiradaeth cyntaf mewn gwirionedd.

Resbiradaeth, ATP, a'r graddiant rhyngddynt

Mae electronau o NADH a FADH2 yn mynd i mewn i'r gadwyn yng nghymhlygion I a II, yn pasio drwy gymhlygyn III i cytocrom c, ac yna drwy gymhlygyn IV i ocsigen. Mae'r egni a ryddheir yng nghymhlygion I, III, a IV yn pwmpio protonau allan o'r matrics i'r gofod rhwng y pilenni. Y gwahaniad hwnnw o wefr ac asidedd yw'r grym gyrru protonau, a'i ran drydanol, sef potensial y bilen, yw'r rhan fwyaf dylanwadol fel arfer.

Mae synthas ATP yn gadael i brotonau lifo'n ôl i'r matrics ac yn defnyddio'r egni a ryddheir i uno ADP a ffosffad i ffurfio ATP. Felly, dyma'r gadwyn:

defnydd o ocsigen, yna pwmpio protonau, yna graddiant, yna synthesis ATP.

Y broblem yw y gall protonau ddychwelyd ar hyd llwybrau eraill. Mae unrhyw ddychweliad sy'n osgoi synthas ATP yn ollyngiad protonau. Mae gollyngiad yn gorfodi'r gadwyn i bwmpio'r un protonau eto i gadw potensial y bilen yn gyson, sy'n defnyddio mwy o ocsigen heb wneud mwy o ATP. Mae gollyngiad digon cryf yn ddatgyplu: mae defnydd o ocsigen yn cynyddu tra bo ATP yn aros yn gyson neu'n gostwng, ac mae'r egni a wastraffwyd yn gadael fel gwres.

Cyflwr 3, cyflwr 4, a'r gymhareb rheolaeth resbiradol

Daw'r eirfa glasurol ar gyfer hyn o fitocondria wedi'u hynysu. Resbiradaeth gyda swbstrad ac ADP yn bresennol yw cyflwr 3: mae synthas ATP yn lleihau'r graddiant, mae potensial y bilen yn gostwng, mae'r gadwyn yn cyflymu i'w ailadeiladu, ac mae defnydd o ocsigen yn uchel oherwydd bod ATP yn cael ei wneud. Resbiradaeth ar ôl i'r ADP gael ei ddefnyddio i gyd yw cyflwr 4: mae synthas ATP yn segur, mae'r graddiant yn cynyddu, mae potensial uchel y bilen yn gwrthsefyll rhagor o bwmpio, ac mae defnydd o ocsigen yn gostwng i'r lefel sydd ei hangen i wneud iawn am ollyngiad.

Mae'r gymhareb rheolaeth resbiradol, cyflwr 3 wedi'i rannu â chyflwr 4, felly'n dangos pa mor dynn y mae'r paratoad wedi'i gyplu. Mae cymhareb uchel yn golygu bod ADP yn rheoli resbiradaeth yn gryf. Mae cymhareb sy'n gostwng gyda chyflwr 4 sy'n cynyddu yn golygu bod gollyngiad yn cymryd drosodd. Drwy'r lens hon y mae canlyniadau glas methylen isod yn gwneud synnwyr.

Mae un model meddyliol yn werth ei gadw. Mae potensial uchel y bilen yn arafu'r gadwyn. Mae gwasgaru'r potensial yn ei chyflymu. Mae'r gadwyn yn ymateb i ba mor anodd y mae pwmpio wedi dod, nid yn uniongyrchol i ba un a yw ATP yn cael ei wneud.

Pan fydd y mesurau terfynol yn newid gyda'i gilydd

Daw'r enghraifft gliriaf o gyplu o fitocondria wedi'u hynysu o ymennydd mochyn cwta gyda chymhlygion resbiradol wedi'u blocio. Gyda glas methylen ar 100 nanomolar i 1 micromolar, cynyddodd defnydd o ocsigen wrth orffwys gyda glwtamad ynghyd â malat, swcsinad, neu glyseroffosffad fel tanwydd, tra nad oedd resbiradaeth a ysgogwyd gan ADP wedi newid. Mewn mitocondria a wenwynwyd yng nghymhlygyn I neu gymhlygyn III, cynyddodd y llifyn gynhyrchu ATP yn gymedrol, adferodd botensial y bilen, a gwella cymeriant calsiwm. Mae'r llwybr arfaethedig yn llwybr byr: mae'r llifyn yn derbyn electronau cyn y bloc ac yn eu trosglwyddo i cytocrom c, gan osgoi'r cymhlygyn sydd wedi'i ddifrodi.

Mae ail achos o gyplu yn defnyddio ffynhonnell ATP hollol wahanol. Mewn mitocondria wedi'u hynysu o'r ymennydd gyda synthas ATP wedi'i atal, roedd glas methylen yn dal i ysgogi resbiradaeth ar bob swbstrad a brofwyd. Ond dim ond ar alffa-cetoglwtarad a glwtamad, y ddau swbstrad sy'n ffurfio swcsinyl CoA, y cynyddodd synthesis ATP. Gydag oligomycin yn blocio synthas ATP, daeth yr ATP ychwanegol o ffosfforyleiddiad ar lefel swbstrad gan ligas swcsinyl CoA yn y cylch asid citrig, nid o ffosfforyleiddiad ocsidiol. Adferodd y llifyn botensial y bilen hefyd pan ataliwyd cymhlygyn I a synthas ATP gyda'i gilydd. Yma, newidiodd defnydd o ocsigen ac ATP gyda'i gilydd, ond dim ond lle roedd y swbstrad yn caniatáu'r ail lwybr ATP. Ar swcsinad neu falat, cynyddodd resbiradaeth heb ATP ychwanegol. Yr un llifyn, yr un siambr, tanwydd gwahanol, ateb gwahanol.

Pan fydd y mesurau terfynol yn ymwahanu

Mae'r achosion o ymwahanu wedi'u cyhoeddi hefyd ac maent yr un mor addysgiadol. Mewn astudiaeth o fitocondria wedi'u hynysu o iau llygod mawr yn 1997, cyflymodd glas methylen resbiradaeth cyflwr 4 mewn mitocondria wedi'u cyplu'n dynn a oedd yn resbiradu gan ddefnyddio swcsinad, gan ostwng y gymhareb rheolaeth resbiradol. Roedd yr effaith yn weladwy o 0.5 micromolar ac yn gryf ar 5 micromolar, crynodiad sy'n agos at lefelau plasma ar ôl bolws mewnwythiennol o 100 milligram. Ar 5 micromolar, chwyddodd y mitocondria hefyd, er bod y diffyg cyplu wedi ymddangos yn gyntaf ar grynodiadau is, sy'n awgrymu bod y gollyngiad wedi dod cyn y difrod strwythurol yn hytrach nag o'i herwydd. Mewn mitocondria wedi'u datgyplu, ysgogodd y llifyn resbiradaeth mewn modd a oedd yn dibynnu ar y crynodiad ac a allai gyrraedd dirlawnder. Cynyddodd defnydd o ocsigen yn y ddau baratoad. Ni chynyddodd synthesis ATP fesul ocsigen a ddefnyddiwyd. Dyna ddatgyplu a chludo electronau fel y'u disgrifir mewn gwerslyfr, yn yr un moleciwl.

Daw'r ymwahanu mwyaf trawiadol o'r retina. Mewn llygod â diffyg AIF a chelloedd ffotodderbynnydd wedi'u trin â rotenone, cadwodd glas methylen drwch y retina, marcwyr ffotodderbynyddion, a strwythur mitocondriaidd, a gostyngodd y gymhareb NADH i NAD a thawelu llwybrau straen gan gynnwys yr ymateb i broteinau heb eu plygu a mitoffagi. Gwnaeth hynny heb gywiro'r diffyg ATP. Mae amddiffyn heb adfer egni yn golygu bod y budd wedi gweithredu drwy gydbwysedd rhydocs a chyfanrwydd mitocondriaidd, nid drwy ATP ychwanegol. Byddai unrhyw un sy'n cyfateb goroesiad y meinwe ag allbwn egni wedi'i adfer yn camddehongli'r arbrawf hwnnw'n llwyr.

Mae'r gwaith ar fitocondria'r ymennydd yn ychwanegu colofn gost at yr un cyfrif. Roedd yr un crynodiadau isel a wellodd fioenergeteg hefyd yn cynyddu cynhyrchu hydrogen perocsid o dan bob amod a brofwyd ac yn arafu ei ddileu, wedi'i fesur gydag assay Amplex wedi'i galibro yn hytrach na llifyn amhenodol. Daeth mwy o ATP a mwy o ocsidydd fel pâr.

Rhestr wirio ymarferol ar gyfer darllen

Mae pedwar cwestiwn yn gwahanu canlyniad wedi'i gyplu oddi wrth un wedi'i ddatgyplu.

Yn gyntaf, pa fesur terfynol a fesurwyd mewn gwirionedd. Ni all defnydd o ocsigen ar ei ben ei hun ddangos ATP. Mae synthesis ATP, potensial y bilen, a'r gymhareb rheolaeth resbiradol yn ychwanegu un darn yr un na all yr electrod ocsigen ei weld. Mae'r canllaw i ddarllen honiadau ymchwil glas methylen yn trafod y ddisgyblaeth hon o ran mesurau terfynol yn fanwl.

Yn ail, pa swbstrad a fwydo'r mitocondria. Mae canlyniad swcsinyl CoA yn dangos y gall y dewis o danwydd benderfynu a all resbiradaeth ychwanegol droi'n ATP ychwanegol o gwbl.

Yn drydydd, pa grynodiad a ddefnyddiwyd. Rhoddodd glas methylen ar grynodiadau nanomolar i micromolar isel mewn mitocondria'r ymennydd enillion bioenergetig cymedrol gyda chost o ran ocsidyddion; gwanhaodd hanner micromolar ac uwch y cyplu mewn mitocondria'r iau; ychwanegodd 5 micromolar chwyddo. Mae crynodiad yn rhan o'r mecanwaith, nid yn fanylyn cefndirol.

Yn bedwerydd, pa fodel a gynhyrchodd y canlyniad. Mae mitocondria wedi'u hynysu yn datgelu'r cysylltiadau, ond mae celloedd a meinweoedd cyfan yn ychwanegu cludiant, rhydwytho i'r ffurf ddi-liw, a derbynyddion sy'n cystadlu am electronau. Gwaith ar ddosio mewn labordy, gan gynnwys sut mae crynodiad a phrotocol yn siapio effeithiau glas methylen, yw'r bont rhwng rhifau'r siambr ac unrhyw honiad am berson.

Mae defnydd o ocsigen yn dangos llif electronau. Mae ATP yn dangos faint o'r llif hwnnw a gipiwyd. Gall glas methylen newid y naill neu'r llall, ac mae'r arbrofion uchod yn dangos y pedwar cyfuniad sy'n dilyn: mae'r ddau'n cynyddu, mae resbiradaeth yn cynyddu dim ond lle mae'r swbstrad yn caniatáu hynny, mae resbiradaeth yn cynyddu tra bo cyplu'n gostwng, ac mae meinwe'n cael ei chadw tra bo ATP yn aros yn gyson. Y rhif ar yr electrod ocsigen yw dechrau'r dehongliad, nid ei ddiwedd.