Metilen mavisinin udma spektri və molyar udma əmsalı: şəraitin göstərildiyi istinad məlumatları

Metilen mavisinin spektri ondan götürülmüş bir rəqəmi yenidən istifadə etməyə çalışana qədər sadə görünür. Bir laboratoriya molyar ekstinksiya əmsalını təxminən 82,000 kimi bildirir. Digəri 67,000 bildirir. Üçüncüsü isə 100,000-dən yüksək qiymət göstərir. Hər üçü öz ölçmələrinin düzgün təsviri ola bilər, lakin onların heç biri bu boya üçün universal sabit deyil.

Qarışıqlıq iki fərqli anlayışın bir-birinə qarışdırılmasından yaranır. Absorbans konkret məhlulun konkret küvetdə ölçülən göstəricisidir. Çox vaxt epsilon ilə işarələnən molyar udma əmsalı isə həmin məhlulun modelindəki parametrdir. Metilen mavisinin assosiasiya vəziyyəti dəyişdikdə model də dəyişir, buna görə parametr də dəyişir. Faydalı yanaşma hər bir əmsalı şəraiti göstərilmiş qiymət kimi qəbul etməkdir: dalğa uzunluğu, həlledici, pH və ya bufer, temperatur, qatılıq diapazonu və optik yol uzunluğu rəqəmlə birlikdə verilməlidir.

Duru sulu məhlulda monomer zolağı

Duru sulu məhlulda metilen mavisi kationunun əsas zolağı 664–665 nm yaxınlığında yerləşir; müxtəlif cihazlar və kalibrləmə seçimləri üçün adətən 664–668 nm diapazonu göstərilir. Məhlul boyanın böyük hissəsinin monomer şəklində qalacağı qədər duru olduqda, kəmiyyət təyini üçün bu zolaq düzgün seçimdir.

Ədəbiyyatdan götürülmüş üç qiymət şəraitin niyə əsas rəqəmdən daha vacib olduğunu göstərir. Sulu nümunələrin qatılığını 1 cm küvetlərdə təxminən 7 mikromolyardan aşağı saxlayan gil tədqiqatçıları 665 nm-də epsilon üçün təxminən 82,000 M-1 cm-1 qiymətini bildirmişlər. Bu qiymət çox duru sulu nümunələr üçün empirik kalibrləmə xəttinin meyli kimi xüsusilə yaxşı sənədləşdirilib. Daha sonra 2.34–37.52 mikromolyar qatılıqlardan və 1 cm optik yoldan istifadə edilən deionlaşdırılmış suda ilkin kalibrləmə ümumi boya üçün 665 nm-də təxminən 67,100 M-1 cm-1 qiymətini verib. Bu daha aşağı nəticə ziddiyyətli deyil, gözləniləndir, çünki həmin kalibrləmə diapazonunun yuxarı yarısında artıq nəzərəçarpan miqdarda dimer mövcuddur. Üçüncü qiymət, 664 nm-də təxminən 73,460 M-1 cm-1, pH 6.86 və 293 K şəraitində aparılmış, müşahidə olunan spektri monomer və dimer hissələrinə ayıran tədqiqatdan götürülüb; bu iş metilen mavisinin fotofizikasına dair son tənqidi icmalda ümumiləşdirilib. Bu rəqəm ayrışdırılmış monomer komponentinə aiddir, absorbansın ümumi boya qatılığından asılılıq xəttinin birbaşa meyli deyil.

Praktik nəticə budur: şəraiti nümunələrinizə uyğun gələn əmsalı seçin və ya öz kalibrləmənizi aparın. 82,000 qiymətini 30 mikromolyar fosfat buferli analizə tətbiq edib xəttiliyin hələ də qüvvədə olduğunu güman etməyin.

Qısa dalğa uzunluğundakı çiyin qarışıqdır

Qatılıq artdıqca 600–615 nm yaxınlığındakı çiyin 664 nm pikə nisbətən böyüyür. Müasir tədqiqatlar H tipli dimerin töhfəsini adətən 605–610 nm yaxınlığında yerləşdirir. Metilen mavisinin suda qlobal spektral təhlili dimer maksimumunu 607 nm-də, daha yüksək dərəcəli aqreqat maksimumunu isə 600 nm-də ayırd edir; monomer rezonans komponentləri 664 və 650 nm-də yerləşir. Onun tam mətni PMID 33251415 üçün açıq girişli qeyd vasitəsilə əlçatandır.

Bu çiyini yalnız dimer absorbansı kimi işarələmək olmaz. Monomerin vibronik quruluşu da eyni bölgəyə töhfə verdiyindən ölçülən hündürlük bu töhfələrin üst-üstə düşməsinin nəticəsidir. Bir qlobal uyğunlaşdırmada monomer və dimerdən ibarət modelin bütün 1.1 mikromolyar–3.4 millimolyar diapazonunda uyğun gəlmədiyi, tetramerin əlavə edilməsinin isə ən yaxşı uyğunluğu verdiyi müəyyən edilib; tetramer siqnalı artıq 34 mikromolyardan aşağı qatılıqlarda aşkar edilə bilirdi. Uyğunlaşdırılmış komponentlərin əmsalları yüksək idi: buferləşdirilməmiş deionlaşdırılmış suda, 0–0.15 M natrium xlorid və 282–333 K temperatur şəraitində əsas monomer komponenti üçün 664 nm-də təxminən 107,800 M-1 cm-1, dimer üçün 607 nm-də təxminən 101,400, tetramer üçün isə 600 nm-də təxminən 138,500. Bunlar modellə ayrılmış hissələrdir, ona görə də empirik Ber–Lambert xəttinin meyli əvəzinə istifadə edilməməlidir.

Dimerləşmənin gücü birbaşa kəmiyyətcə müəyyən edilib. pH 6.86 və 293 K şəraitində bir tədqiqatda təxminən 3,900 M-1 dimerləşmə sabiti əldə edilib. Bu qiymət 5 mikromolyar işçi məhlulun niyə demək olar ki, xətti davrandığını, 50 mikromolyar ilkin məhlulun isə belə davranmadığını izah edir. Metodun hazırlanması zamanı faydalı yoxlama 610 nm yaxınlığındakı absorbansın 665 nm yaxınlığındakı absorbansa nisbətidir. Bu nisbət qatılıqla artdıqda, 664 nm-dəki epsilon artıq dəyişməz bir kimyəvi növü təsvir etmir.

Bir-birinə çevrilən tək bir cütün üstünlük təşkil etdiyi qatılıq intervalında spektrlərin ortaq izosbestik nöqtəsi ola bilər; sulu məhlul seriyalarında bu nöqtə təcrübədə 625 nm yaxınlığında müşahidə edilir. Aydın, sabit nöqtə iki üstün kimyəvi növün mövcudluğu ilə uyğun gəlir. Qatılıq artdıqca nöqtə yerini dəyişir və ya yox olursa, bunu cihaz xətası deyil, daha yüksək dərəcəli aqreqatların və ya dəyişən tarazlıqların meydana çıxmasına dair xəbərdarlıq kimi qəbul edin.

Həlledici, pH və temperatur spektri dəyişdirir

Su assosiasiyaya əlverişli şərait yaradır. PMID 30933781 kimi indekslənmiş metilen mavisinin su və DMSO qarışıqlarında həlledici təsirinə dair tədqiqata görə, dimetilsulfoksidin əlavə edilməsi dimerləşməni zəiflədir, udma və flüoressensiya maksimumlarını daha uzun dalğa uzunluqlarına sürüşdürür və flüoressensiyanın kvant çıxımını təxminən dörd dəfə artırır. Həmin işdə sulu məhlulların spektrləri monomer absorbansı 650–670 nm, dimer absorbansı isə 580–615 nm yaxınlığında olan monomer–dimer tarazlığı kimi nəzərdən keçirilir və 293.15 K-dəki spektrlərdən dimerləşmə sabitləri hesablanır.

Spirtlər həm maksimumun mövqeyini, həm də görünən intensivliyi dəyişdirir, lakin aqreqasiyanı aradan qaldırmır. Metilen mavisinin həlledicilərinə dair tədqiqatda bildirilən, 31.3 mikromolyar qatılıqda və otaq temperaturunda aparılmış bir ilkin müqayisədə uzun dalğa maksimumu suda 665 nm, metanolda isə 655 nm olub; bütöv məhlul üçün görünən əmsallar suda təxminən 37,100, metanolda isə 60,800 təşkil edib. 298 K-də mütləq etanolda aparılmış ayrıca validasiya maksimumu 655 nm-də, epsilonu isə təxminən 68,000 göstərib.

Adi pH dəyişiklikləri spektri bir çox protokolun güman etdiyindən daha az dəyişdirir. Yuxarıda istinad edilən tənqidi icmalda bildirilir ki, təxminən pH 2-dən pH 12-yə qədər maksimum 665 nm yaxınlığında qalıb, pH 11-ə qədər isə intensivlik yalnız cüzi dəyişib. Buferin növü və ion qüvvəsi nəticələri nominal pH qədər dəyişdirə bilər; buna görə yalnız pH-metrin göstəricisini deyil, istifadə olunan buferi və duzu da qeyd edin. Güclü turşu və ya güclü qələvi ayrıca haldır, çünki boya dönər assosiasiya əvəzinə kimyəvi dəyişikliyə məruz qala bilər. Temperatur və duz da tarazlığı dəyişdirir; buna görə 2020-ci ildə suda aparılmış tədqiqatda hər ikisi məqsədli şəkildə dəyişdirilib.

Rəqəmin etibarlılığını qoruyan ölçmələr

Kəmiyyət təyini Ber–Lambert münasibətinə — absorbansın epsilon, qatılıq və optik yol uzunluğunun hasilinə bərabər olmasına — və xətti intervalın sizin şəraitinizdə həqiqətən qüvvədə olduğunun sübutuna əsaslanır.

Aşağı mikromolyar qatılıqlarda işləmək üçün 1 cm küvetdən istifadə edin. Epsilon təxminən 82,000 olduqda, 5 mikromolyar qatılıq təxminən 0.41, 10 mikromolyar isə təxminən 0.82 absorbans verir. Sadə suda monomerə yönəlmiş ölçmə üçün təxminən 5–7 mikromolyar yaxınlığında və ya ondan aşağı qalmaq, onlarla mikromolyar qatılıqlara qədər kalibrləmə aparmaqdan daha etibarlıdır. Qatı ilkin məhlullar üçün 1-dən xeyli yüksək absorbansı qəbul etmək əvəzinə optik yolu qısaldın.

Eyni matriksdən boya olmadan istifadə edərək kor ölçmə aparın: eyni su keyfiyyəti, eyni əlavə həlledici payı, eyni bufer və duzlar. Kalibrləmə məhlullarını həmin matriksdə və eyni temperaturda hazırlayın. Metodun hazırlanması zamanı tək bir dalğa uzunluğunda ölçmə aparmaq əvəzinə bütün görünən diapazonu, ideal olaraq təxminən 550–750 nm-ni skan edin. Yalnız hündürlüyü deyil, formanı da izləyin. Ardıcıl durulaşdırma normallaşdırılmış formanı dəyişdirirsə, sistem kimyəvi baxımdan qatılıqdan asılıdır. Sabit maksimum və sabit 610–665 nm nisbəti, təkcə yüksək R kvadrat göstəricisindən daha güclü şəkildə diapazonun uyğun olduğunu təsdiqləyir.

Reagentin formasını sənədləşdirin. Kommersiya materialı susuz metiltioninium xlorid və ya trihidrat kimi bir hidrat ola bilər; buna görə ilkin məhlulun hesablamalarında istifadə olunan molyar kütlə qabdakı faktiki maddəyə uyğun gəlməlidir. Təkcə bu addım laboratoriyalar arasında nominal molyar qatılıqlarla bağlı fərqlərin bir hissəsini izah edir. Nəticələr kəmiyyət analizi hesablamalarında istifadə ediləndə, spektrlər formulasiya sabitliyinin yoxlanılmasını dəstəkləyəndə və qarışıq profilləri saflıq və spesifikasiyanın nəzərdən keçirilməsini tələb edəndə də eyni dəqiqlik tətbiq olunmalıdır.

Şəraitin göstərildiyi xülasə

Bu cədvəldən bir-birini əvəz edə bilən sabitlərin mənbəyi kimi deyil, laboratoriya qeydləri üçün başlanğıc şablon kimi istifadə edin.

Beləliklə, metilen mavisinin absorbans dalğa uzunluğu uzun izah qeydi tələb edən qısa cavabdır. Ölçdüyünüz piki, ölçdüyünüz məhlulu və ölçməni apardığınız qatılığı birlikdə bildirin. Bu vərdiş duru sulu məhlulda 664 nm yaxınlığında alınmış bir qiymətin yanlış universal sabitə çevrilməsinin qarşısını alır.