Metilen mavisi və ATP: daha çox oksigen sərfi daha çox enerji deməkdirmi?

Təcrid edilmiş bir mitoxondri yanacaq olan, lakin ADP olmayan kameradadır. O, oksigeni yavaş-yavaş sərf edir. ADP əlavə etdikdə oksigen sərfi bir neçə dəfə artır. ADP tükənənə qədər gözlədikdə oksigen sərfi yenidən azalır. Yanacaq dəyişməyib. Dəyişən yalnız ATP-yə olan tələbatdır.

Bu qısa ardıcıllıq məqalənin bəhs etdiyi fərqi bütövlükdə əks etdirir. Oksigen sərfi elektronların tənəffüs zənciri boyunca oksigenə doğru nə qədər sürətlə hərəkət etdiyini ölçür. ATP istehsalı isə bu axının nə qədərinin istifadə edilə bilən enerji kimi tutulduğunu ölçür. Hər ikisinin ortaq aralıq mərhələsi var: mitoxondrinin daxili membranı boyunca proton qradiyenti. Qradiyentin ATP sintezi ilə nə dərəcədə sıx əlaqələndiyini dəyişən hər bir amil bu iki son göstəricini müxtəlif istiqamətlərə yönəldə bilər. Metilen mavisi burada yaxşı izah vasitəsidir, çünki onun hər iki cür təsiri müşahidə edilib: bəzi preparatlarda ATP ilə yanaşı oksigen sərfini artırır, digərlərində isə ATP dəyişmədiyi və ya azaldığı halda oksigen sərfini artırır.

Əvvəlcə elektron ötürülməsinin ümumi mənzərəsini öyrənmək istəyən oxucular metilen mavisinin elektronları tənəffüs zənciri boyunca necə daşımasından başlaya bilərlər. Erkən oksigen təcrübələrinin terminologiyasını öyrənmək istəyənlər isə ilk tənəffüs ölçmələrinin əslində nə göstərdiyini oxuya bilərlər.

Tənəffüs, ATP və onların arasındakı qradiyent

NADH və FADH2-dən gələn elektronlar zəncirə I və II komplekslərdən daxil olur, III kompleksdən keçərək sitoxrom c-yə, sonra isə IV kompleksdən keçərək oksigenə çatır. I, III və IV komplekslərdə ayrılan enerji protonları matriksdən membranlararası boşluğa vurur. Elektrik yükünün və turşuluğun bu şəkildə ayrılması proton hərəkətverici qüvvəsini yaradır. Onun elektrik komponenti olan membran potensialı adətən üstünlük təşkil edir.

ATP sintaza protonların matriksə geri axmasına imkan verir və ayrılan enerjidən ADP ilə fosfatı birləşdirərək ATP yaratmaq üçün istifadə edir. Beləliklə, ardıcıllıq belədir:

oksigen sərfi, sonra protonların vurulması, sonra qradiyent, sonra ATP sintezi.

Məsələ ondadır ki, protonlar başqa yollarla da geri qayıda bilər. ATP sintazadan yan keçən hər bir geri qayıdış proton sızmasıdır. Sızma membran potensialını sabit saxlamaq üçün zənciri eyni protonları yenidən vurmağa məcbur edir. Bu isə daha çox ATP yaratmadan daha çox oksigen sərf edir. Kifayət qədər güclü sızma əlaqələnmənin pozulması deməkdir: oksigen sərfi artır, ATP isə dəyişmir və ya azalır, boşa gedən enerji də istilik şəklində ayrılır.

Vəziyyət 3, vəziyyət 4 və tənəffüs nəzarəti nisbəti

Bunun klassik terminologiyası təcrid edilmiş mitoxondrilər üzərində aparılan işlərdən gəlir. Vəziyyət 3 substrat və ADP mövcud olduqda baş verən tənəffüsdür: ATP sintaza qradiyenti azaldır, membran potensialı enir, zəncir onu bərpa etmək üçün sürətlənir və ATP istehsal olunduğuna görə oksigen sərfi yüksək olur. Vəziyyət 4 isə ADP tükəndikdən sonrakı tənəffüsdür: ATP sintaza fəaliyyətsiz qalır, qradiyent artır, yüksək membran potensialı protonların daha çox vurulmasına müqavimət göstərir və oksigen sərfi sızmanı kompensasiya etmək üçün lazım olan səviyyəyə düşür.

Buna görə də vəziyyət 3-ün vəziyyət 4-ə nisbəti olan tənəffüs nəzarəti nisbəti preparatda əlaqələnmənin nə qədər sıx olduğunu göstərir. Yüksək nisbət ADP-nin tənəffüsə güclü nəzarət etdiyini bildirir. Vəziyyət 4 yüksələrkən nisbətin azalması sızmanın üstünlük qazanması deməkdir. Aşağıdakı metilen mavisi nəticələrini bu baxışla anlamaq olar.

Bir zehni modeli yadda saxlamağa dəyər. Yüksək membran potensialı zənciri yavaşladır. Potensialın azalması onu sürətləndirir. Zəncir birbaşa ATP-nin istehsal olunub-olunmamasına deyil, protonların vurulmasının nə qədər çətinləşdiyinə reaksiya verir.

Son göstəricilər birlikdə dəyişəndə

Əlaqələnmənin ən aydın nümunəsi tənəffüs kompleksləri bloklanmış, təcrid edilmiş dəniz donuzu beyin mitoxondriləri üzərində aparılan təcrübədən gəlir. Metilen mavisinin 100 nanomolar ilə 1 micromolar arasındakı konsentrasiyalarında yanacaq kimi qlutamat və malat, suksinat və ya qliserofosfat istifadə edildikdə sakit vəziyyətdə oksigen sərfi artmış, ADP ilə stimullaşdırılan tənəffüs isə dəyişməmişdi. I və ya III kompleksi zəhərləyici təsirlə bloklanmış mitoxondrilərdə boya ATP istehsalını cüzi artırmış, membran potensialını bərpa etmiş və kalsiumun qəbulunu yaxşılaşdırmışdı. Təklif olunan yol qısa keçiddir: boya bloklanmış hissədən əvvəl elektronları qəbul edir və zədələnmiş kompleksdən yan keçərək onları sitoxrom c-yə ötürür.

İkinci əlaqələnmiş nümunədə tamamilə fərqli ATP mənbəyindən istifadə olunur. ATP sintazası inhibə edilmiş təcrid olunmuş beyin mitoxondrilərində metilen mavisi sınaqdan keçirilən bütün substratlarda yenə də tənəffüsü stimullaşdırmışdı. Lakin ATP sintezi yalnız suksinil CoA əmələ gətirən iki substratda — alfa-ketoqlutarat və qlutamatda — artmışdı. ATP sintaza oliqomisinlə bloklandıqda əlavə ATP oksidləşdirici fosforlaşmadan deyil, limon turşusu dövründə suksinil CoA liqaza vasitəsilə substrat səviyyəsində fosforlaşmadan yaranmışdı. I kompleks və ATP sintaza birlikdə inhibə edildikdə boya membran potensialını da bərpa etmişdi. Burada oksigen sərfi və ATP birlikdə artmışdı, lakin yalnız substratın ikinci ATP yoluna imkan verdiyi hallarda. Suksinat və ya malatda tənəffüs əlavə ATP yaranmadan artmışdı. Eyni boya, eyni kamera, fərqli yanacaq, fərqli nəticə.

Son göstəricilər bir-birindən ayrıldıqda

Göstəricilərin ayrıldığı hallar da dərc edilib və eyni dərəcədə öyrədicidir. 1997-ci ildə təcrid edilmiş siçovul qaraciyər mitoxondriləri üzərində aparılmış tədqiqatda metilen mavisi suksinatla tənəffüs edən, sıx əlaqələnmiş mitoxondrilərdə vəziyyət 4 tənəffüsünü sürətləndirmiş və bununla tənəffüs nəzarəti nisbətini aşağı salmışdı. Təsir 0.5 micromolar konsentrasiyadan başlayaraq görünmüş və 5 micromolar səviyyəsində güclü olmuşdu. Bu konsentrasiya 100 milligram venadaxili bolusdan sonra plazmadakı səviyyələrə yaxındır. 5 micromolar konsentrasiyada mitoxondrilər həm də şişmişdi. Lakin əlaqələnmə qüsuru əvvəlcə daha aşağı konsentrasiyalarda ortaya çıxmışdı. Bu, sızmanın struktur zədələnmədən qaynaqlanmadığını, ondan əvvəl baş verdiyini göstərir. Əlaqələnməsi pozulmuş mitoxondrilərdə boya tənəffüsü konsentrasiyadan asılı, doyma həddinə çatan şəkildə stimullaşdırmışdı. Hər iki preparatda oksigen sərfi artmışdı. Sərf olunan oksigenə düşən ATP sintezi isə artmamışdı. Bu, eyni molekulda həm əlaqələnmənin pozulmasının, həm də elektron daşınmasının klassik nümunəsidir.

Ən diqqətçəkən ayrılma tor qişada müşahidə olunur. AIF çatışmazlığı olan siçanlarda və rotenonla işlənmiş fotoreseptor hüceyrələrdə metilen mavisi tor qişanın qalınlığını, fotoreseptor markerlərini və mitoxondrial quruluşu qorumuş, NADH-nin NAD-yə nisbətini azaltmış və qatlanmamış zülal cavabı ilə mitofagiya da daxil olmaqla stress yollarının fəallığını zəiflətmişdi. Bunlar ATP çatışmazlığı aradan qaldırılmadan baş vermişdi. Enerji bərpa olunmadan qorunmanın baş verməsi faydanın əlavə ATP vasitəsilə deyil, redoks tarazlığı və mitoxondrial bütövlük vasitəsilə yarandığını göstərir. Toxumanın sağ qalmasını enerji istehsalının bərpasına bərabər tutan hər kəs bu təcrübəni tamamilə yanlış şərh etmiş olar.

Beyin mitoxondriləri üzərində aparılan işlər eyni mənzərəyə əlavə bir mənfi tərəf də gətirir. Bioenergetikanı yaxşılaşdıran həmin aşağı konsentrasiyalar sınaqdan keçirilən bütün şəraitlərdə hidrogen peroksidin yaranmasını da artırmış və onun aradan qaldırılmasını yavaşlatmışdı. Bu, qeyri-spesifik boya ilə deyil, kalibrlənmiş Amplex analizi ilə ölçülmüşdü. Daha çox ATP ilə daha çox oksidləşdirici maddə birlikdə yaranmışdı.

Nəticələri oxumaq üçün praktik yoxlama siyahısı

Dörd sual əlaqələnmiş nəticəni əlaqələnməsi pozulmuş nəticədən ayırmağa kömək edir.

Birincisi, əslində hansı son göstərici ölçülüb? Təkcə oksigen sərfi ATP haqqında məlumat verə bilməz. ATP sintezi, membran potensialı və tənəffüs nəzarəti nisbətinin hər biri oksigen elektrodunun görə bilmədiyi bir hissəni əlavə edir. Metilen mavisi tədqiqatlarındakı iddiaları oxumaq üçün bələdçi son göstəricilərə bu ciddi yanaşmanı ətraflı izah edir.

İkincisi, mitoxondrilər hansı substratla qidalanıb? Suksinil CoA nəticəsi göstərir ki, yanacaq seçimi əlavə tənəffüsün ümumiyyətlə əlavə ATP-yə çevrilib-çevrilməyəcəyini müəyyən edə bilər.

Üçüncüsü, hansı konsentrasiyadan istifadə edilib? Beyin mitoxondrilərində nanomolar ilə aşağı micromolar aralığındakı metilen mavisi oksidləşdirici yükün artması bahasına cüzi bioenergetik yaxşılaşma vermişdi; qaraciyər mitoxondrilərində yarım micromolar və daha yüksək konsentrasiyalar əlaqələnməni zəiflətmişdi; 5 micromolar səviyyəsində buna şişmə də əlavə olunmuşdu. Konsentrasiya ikinci dərəcəli təfərrüat deyil, mexanizmin bir hissəsidir.

Dördüncüsü, nəticə hansı modeldə əldə edilib? Təcrid edilmiş mitoxondrilər daxili əlaqələri üzə çıxarır, lakin bütöv hüceyrələr və toxumalar bu mənzərəyə daşınmanı, rəngsiz formaya reduksiyanı və elektronlar üçün rəqabət aparan digər qəbuledici yolları da əlavə edir. Konsentrasiya və protokolun metilen mavisinin təsirlərini necə formalaşdırması da daxil olmaqla laboratoriyada dozaların tətbiqi üzrə işlər kamerada ölçülən rəqəmlərlə insan haqqında hər hansı iddia arasında körpüdür.

Oksigen sərfi elektron axınını göstərir. ATP isə bu axının nə qədərinin tutulduğunu göstərir. Metilen mavisi bunların hər birini dəyişə bilər və yuxarıdakı təcrübələr bunun dörd müxtəlif nəticəsini göstərir: hər ikisi artır; tənəffüs yalnız substratın imkan verdiyi hallarda artır; əlaqələnmə zəiflədiyi halda tənəffüs artır; ATP dəyişmədiyi halda toxuma qorunur. Oksigen elektrodundakı rəqəm şərhin sonu deyil, başlanğıcıdır.