Metilen mavisi və Bartonella: laboratoriya nəticələri və klinik sübutların məhdudiyyətləri

Kultura qabı ilə pasiyent üçün eyni söz — infeksiya — işlədilir, lakin bu söz hər iki halda eyni anlayışı ifadə etmir. Qabda infeksiya aqardakı koloniyaların sayıdır. Pasiyentdə isə bu, hüceyrələrin və damarların daxilindəki bakteriyalar, qan və toxumalarda hərəkət edən dərmanlar və işin bir hissəsini yerinə yetirən immun sistemidir. Bunları qarışdırdıqda təsirli bir laboratoriya göstəricisi müalicə üsulu kimi görünməyə başlayır. Onları ayrı tutduqda isə həmin göstərici əslində nədirsə, o olaraq qalır: növbəti təcrübəni aparmaq üçün əsas.

Metilen mavisi və Bartonella haqqında bu icmalın əsas vəzifəsi məhz həmin fərqi qorumaqdır. Eyni tədqiqat qrupunun iki laboratoriya tədqiqatında metilen mavisi böyüməyən vəziyyətdəki Bartonella henselae-yə qarşı sınaqdan keçirilib. Hər ikisində şüşə və plastik qablarda güclü aktivlik qeydə alınıb. Heç birində insan üzərində sınaq aparılmayıb.

Tədqiqatçılar niyə stasionar fazanı sınaqdan keçirirlər

Antibiotik sınaqlarının çoxunda böyüyən hüceyrələrdən istifadə olunur. Bu model daha çətin bir vəziyyəti nəzərdən qaçırır: bölünməyi dayandırmış və böyüyən həmcinslərini öldürən dərmanlara dözən hüceyrələri.

Bartonella orqanizmdə, o cümlədən eritrositlərin və endotel hüceyrələrinin daxilində qala bilər. Buna görə qrup hansı təsdiqlənmiş dərmanların stasionar fazaya keçmiş B. henselae-ni öldürə bildiyini araşdırıb. Böyüyən hüceyrələrə qarşı aşağı MIC stasionar fazada öldürücü təsiri proqnozlaşdırmayıb. Rifampinin MIC göstəricisi çox aşağı olsa da, stasionar hüceyrələri zəif öldürüb; daha yüksək MIC göstəricilərinə malik birləşmələr isə onları yaxşı öldürüb. Bu tip məqalələri oxumaq üçün ümumi yanaşma axtaran oxucular onu metilen mavisi tədqiqatlarını oxumağa dair bələdçidə tapa bilərlər.

İlkin skrininq: Li və həmkarları, 2019

Antibiotics jurnalında dərc edilmiş 2019-cu il stasionar faza skrininqində yalnız bir ştammdan — B. henselae JK53-dən istifadə olunub. O, 10 faiz fetal iribuynuzlu heyvan serumu əlavə edilmiş Schneider mühitində, 37 C temperaturda və 5 faiz CO2 şəraitində yetişdirilib. Bir günlük kulturlar əsasən səpələnmiş, bölünən hüceyrələrdən ibarət olub. mL başına təxminən 10-un 8-ci qüvvəti qədər koloniya əmələ gətirən vahid olan beş günlük kulturlar stasionar faza kimi qəbul edilib və görünən aqreqatlar ehtiva edib.

Analiz üçün propidium yodidlə birlikdə SYBR Green I istifadə edilib və üsul canlı hüceyrələrlə izopropanolla öldürülmüş hüceyrələrin qarışıqlarına əsasən kalibrlənib. Metilen mavisi güclü rəngə malik olduğundan aktiv nəticələr əvvəlcə mikroskopiya, sonra isə daha ciddi son göstərici olan qanlı aqarda koloniya sayımı ilə təsdiqlənib.

50 mikromolyar konsentrasiyada sınaqdan keçirilmiş 1,581 təsdiqlənmiş dərman arasında metilen mavisindən sonra canlılıq mikroplitə oxuyucusuna görə 16 faiz, mikroskopiyaya görə isə 25 faiz qalıb. Daptomisin üçün göstərici 21 faiz, bir neçə azol üçün 22–27 faiz, gentamisin üçün 32 faiz, eritromisin üçün 66 faiz, siprofloksasin üçün 74 faiz olub. Pirvinium pamoat oxuyucuda daha güclü görünürdü, lakin öz flüoressensiyasına görə mikroskopiya ilə qiymətləndirilə bilməyib.

Böyüyən B. henselae-yə qarşı metilen mavisinin MIC göstəricisi mL başına 0.08–0.16 mikroqram olub. Beş günlük stasionar hüceyrələrdə mL başına 5 mikroqram konsentrasiyada bir günlük məruz qalmadan sonra aşkar edilə bilən koloniya qalmayıb. Bu nəticə sınaqdan keçirilmiş konsentrasiyalarında daptomisin və pirvinium pamoatın nəticələrinə uyğun olub. Zamandan asılı öldürmə təsirini ölçən ayrıca sınaqda mL başına 10 mikroqram istifadə edilib. Bunlar doza deyil, laboratoriyada məruz qalma səviyyələridir və məqalədə də belə təqdim olunur. İnsanlarda təxminən mL başına 3.9 mikroqram olan pik plazma göstəricisinə məqalədə yalnız ümumi kontekst kimi istinad edilir. Metilen mavisinin farmakokinetikasına dair icmal plazma göstəricisinin niyə toxuma göstəricisi kimi qəbul edilə bilməyəcəyini izah edir.

Məqalədə iki məhdudiyyət açıq göstərilir. Biofilm modeli olmayıb və metilen mavisinin kombinasiyaları sınaqdan keçirilməyib. Beş günlük aqreqatlar stasionar maye kulturadakı hüceyrə topaları olub, təsdiqlənmiş biofilm təcrübəsi deyil. Müəlliflər heyvanlar üzərində işlərə, kombinasiya və biofilm tədqiqatlarına, eləcə də digər Bartonella növlərində sınaqlara ehtiyac olduğunu bildiriblər.

Kombinasiyalar və biofilmdən əldə edilmiş hüceyrələr: Zheng və həmkarları, 2020

BMC Microbiology jurnalında dərc edilmiş 2020-ci il davam tədqiqatında eyni ştamm və mühit saxlanılıb, lakin altı günlük stasionar kulturlara keçilib və ilk məqalədə olmayan iki element əlavə edilib: iki preparatlı kombinasiyalar və biofilmdən əldə edilmiş hüceyrə modeli.

Ayrı-ayrı dərmanlar 24 saat ərzində eyni, mL başına 5 mikroqram konsentrasiyada tətbiq edildikdə metilen mavisindən sonra mL başına 10-un 4-cü qüvvətinin 3.2 misli qədər koloniya əmələ gətirən vahid qalıb; nəzarət qrupunda isə bu göstərici 10-un 10-cu qüvvətinin təxminən 2.8 misli olub. Eyni vaxt nöqtəsində siprofloksasin, gentamisin və nitrofurantoindən sonra daha az koloniya qalıb. Bu, 2019-cu ilin nəticəsindən fərqlənir: həmin tədqiqatda eyni nominal səviyyədə bir gündən sonra aşkar edilə bilən koloniya qalmamışdı. Kulturların yaşı, sıxlığı və işlənmə qaydası fərqli olub, buna görə öldürücü təsirin istiqaməti təkrarlanıb, lakin miqyası eyni olmayıb. Sınaqlar arasındakı bu dəyişiklik standart təhlükəsizlik və qarşılıqlı təsir yoxlamalarında laboratoriya təsir gücünün klinik təsirdən ayrı qiymətləndirilməsinin səbəblərindən biridir.

Kombinasiya skrininqi ən çox istinad edilən hissədir. Hər bir komponentin konsentrasiyası mL başına 5 mikroqram olaraq sabit saxlanılıb. Həm azitromisin və metilen mavisi, həm də rifampin və metilen mavisi kombinasiyasından sonra 24 saatda stasionar fazaya aid aşkar edilə bilən koloniya qalmayıb. Siprofloksasinli hər iki cütlükdə də eyni nəticə alınıb və sınaqdan keçirilmiş 25 cütlük arasında yalnız bu dördündə belə olub. Formal sinergiya analizi aparılmayıb, buna görə düzgün ifadə sübut edilmiş sinergiya deyil, bu şəraitdə aktiv kombinasiya olmalıdır.

Biofilm təcrübəsində bütöv, yetkin biofilmə nüfuzetmə deyil, parçalanmış gənc biofilmdən əldə edilmiş hüceyrələr sınaqdan keçirilib. Kulturlar beş gün yetişdirilib, durulaşdırılaraq quyucuqlu lövhələrə köçürülüb və daha beş gün saxlanılıb. Biofilm kristal violetlə boyanma vasitəsilə təsdiqlənib, sonra dərmana məruz qoyulmazdan əvvəl qaşınıb götürülüb. mL başına 5 mikroqram konsentrasiyada yalnız metilen mavisi tətbiq edildikdə göstərici 6-cı günə qədər 10-un 2-ci qüvvətinin 2.3 mislinə enib. Bu, ayrıca tətbiq edilən preparatlar arasında ən yaxşı nəticələrdən biri olsa da, sıfır olmayıb. Metilen mavisili hər iki kombinasiya, eləcə də siprofloksasinli hər iki kombinasiya 6-cı günə qədər sıfır göstəricisinə çatıb.

Müəlliflər diqqətli oxucunun da görəcəyi məhdudiyyətləri qeyd ediblər: köhnə, bütöv biofilm əvəzinə qaşınaraq götürülmüş gənc biofilm; hər dərmanın öz real pik səviyyəsi əvəzinə bütün dərmanlar üçün vahid, praktik konsentrasiya; yalnız azitromisin və ya rifampin əsasında seçilmiş cütlüklər; bir ştamm; heyvanların və pasiyentlərin olmaması. Sonrakı üç preparatlı tədqiqatlar təklif edilib, lakin onların nəticələri təqdim olunmayıb.

Tədqiqat dizaynlarının müqayisəsi

Cədvəl bu məqalənin əsas fikrini yığcam şəkildə göstərir. Son sütundan soldakı hər şey kultura üzərində aparılan işdir. Heç bir məqalədə son sütuna uyğun məlumat yoxdur.

Bartonella Borrelia deyil

Hər iki məqalədə Laym xəstəliyinin spiroxeti olan Borrelia burgdorferi qeyd edilir. Bunun səbəbi boyaya əsaslanan analizin eyni laboratoriyada əvvəllər Borrelia-nın stasionar fazası üzərində aparılmış işlərdən götürülməsidir; həmin işlərdə də metilen mavisi və daptomisin aktiv nəticə verib. Bu tarixçə faydalı kontekstdir, eyni zamanda tez-tez səhvə səbəb olur.

Bartonella haqqında bu iki məqalənin heç bir təcrübəsində Borrelia Bartonella ilə yanaşı sınaqdan keçirilmir. Orqanizmlər, mühitlər və konsentrasiyalar fərqlidir. Metilen mavisinin Bartonella membranına ehtimal edilən təsiri də əlavə araşdırma tələb edən fərziyyə kimi təqdim olunub. Nəticələr bir növdən digərinə şamil edilməməlidir və heç bir məqalə parazitlər haqqında geniş iddiaları dəstəkləmir. Borrelia və Bartonella persister hüceyrələrinin müqayisəsi məhz bu səbəbdən bu iki tədqiqat sahəsini ayrı saxlayır.

Kultura nəticələri niyə protokola çevrilmir

Metilen mavisi və Bartonella üçün protokol axtarışlarına maraq başadüşüləndir. Bu məqalələr həmin ifadənin niyə alış-veriş siyahısı deyil, xəbərdarlıq işarəsi kimi qəbul edilməli olduğunu göstərir.

Birincisi, quyucuqda mL başına 5 mikroqram resept deyil. Bu göstərici sorulma, paylanma, zülallarla bağlanma, hüceyrədaxili nüfuzetmə və ya dözümlülük barədə heç nə demir. Müəlliflər onu antibiotiklərin pik səviyyələrinin təxmini ortalaması kimi seçiblər və gələcək işlərdə hər dərmanın öz real səviyyəsində istifadə edilməli olduğunu bildiriblər.

İkincisi, sıfır koloniya həmin əkmə şəraitində koloniyaların olmaması deməkdir, steril toxuma deyil. Persister hüceyrələr, hüceyrədaxili bakteriyalar və nümunə götürmənin məhdudiyyətləri aqar lövhəsinin əhatəsindən kənarda qalır.

Üçüncüsü, quyucuqda mikroorqanizmləri tam aradan qaldıran kombinasiyalar orqanizmdə uğursuz ola və ya zərər verə bilər. Azitromisin və metilen mavisi, eləcə də rifampin və metilen mavisi laboratoriya məruz qalma səviyyələrində sınaqdan keçirilmiş laboratoriya cütlükləridir. Heyvanlarda farmakokinetika və insanlarda nəzarətli tədqiqat məlumatları olmadan doza, müddət və fayda-risk nisbəti müəyyən edilməyib. Seçimləri dəyərləndirən hər kəs onları həkimlə müzakirə etməli və kultura qabındakı məlumatlardan nəticə çıxarmazdan əvvəl metilen mavisinin istifadəsinin nə vaxt tibbi nəzarət tələb etdiyini nəzərdən keçirməlidir.

Bu məqalələrin dəstəklədiyi məhdud nəticə belədir: metilen mavisi böyüməyən B. henselae JK53-ə qarşı in vitro, o cümlədən iki preparatlı laboratoriya kombinasiyalarında təkrarlana bilən aktivlik göstərir. Kombinasiyalar və biofilmdən əldə edilmiş hüceyrələr üzrə ən güclü nəticələr 2020-ci il tədqiqatından gəlir. Bu aktivliyin insanlarda bartonellyoz üçün əhəmiyyət daşıyıb-daşımaması da daxil olmaqla, qalan hər şey hələ sınaqdan keçirilməyib.