Спектри ҷаббиши кабуди метиленӣ ва қобилияти молярии ҷаббиш: маълумотнома бо нишон додани шароит

Спектри кабуди метиленӣ то замоне сода менамояд, ки кӯшиш кунед яке аз қиматҳои онро дубора истифода баред. Як озмоишгоҳ коэффисиенти молярии экстинксияро тақрибан 82,000 гузориш медиҳад. Дигаре 67,000-ро нишон медиҳад. Савумӣ қимати зиёда аз 100,000-ро меорад. Ҳар се метавонанд ченкуниҳои худро дуруст тавсиф кунанд, аммо ҳеҷ кадом собитаи умумӣ барои ин рангкунанда нест.

Нофаҳмӣ аз омехта кардани ду мафҳуми ҷудогона ба вуҷуд меояд. Абсорбанс натиҷаи ченкунии маҳлули мушаххас дар кюветаи мушаххас аст. Қобилияти молярии ҷаббиш, ки аксар вақт бо эпсилон ифода мешавад, параметри модели ҳамин маҳлул аст. Вақте ҳолати ассотсиатсияи кабуди метиленӣ тағйир меёбад, модел низ тағйир меёбад ва дар натиҷа параметр ҳам дигар мешавад. Равиши муфид ин аст, ки ҳар коэффисиентро ҳамчун қимате бо шароити муайян қабул кунед: дарозии мавҷ, ҳалкунанда, pH ё буфер, ҳарорат, фосилаи консентратсия ва дарозии роҳи оптикӣ бояд ҳамроҳи рақам оварда шаванд.

Банди мономерӣ дар маҳлули тунуки обӣ

Дар маҳлули тунуки обӣ банди асосии катиони кабуди метиленӣ наздики 664 то 665 nm ҷойгир аст; вобаста ба асбоб ва интихоби калибркунӣ онро одатан дар фосилаи 664 то 668 nm нишон медиҳанд. Ин банд барои муайянкунии миқдорӣ интихоби дуруст аст, агар маҳлул ба қадри кофӣ тунук бошад ва қисми зиёди рангкунанда дар шакли мономерӣ қарор дошта бошад.

Се қимат аз адабиёти илмӣ нишон медиҳанд, ки чаро шароит аз рақами асосӣ муҳимтар аст. Муҳаққиқони гил, ки намунаҳои обиро дар кюветаҳои 1 cm бо консентратсияи камтар аз тақрибан 7 micromolar нигоҳ медоштанд, эпсилонро дар 665 nm тақрибан 82,000 M-1 cm-1 гузориш додаанд. Ин қимат ҳамчун нишебии таҷрибавии хати калибркунӣ барои намунаҳои хеле тунуки обӣ ба таври махсусан хуб ҳуҷҷатгузорӣ шудааст. Баъдтар калибркунии ибтидоӣ дар оби деионидашуда, бо истифода аз консентратсияи 2.34 то 37.52 micromolar ва роҳи оптикии 1 cm, барои миқдори умумии рангкунанда дар 665 nm тақрибан 67,100 M-1 cm-1 дод. Натиҷаи пасттар интизоршаванда аст ва зиддият надорад, зеро дар нимаи болоии ин фосилаи калибркунӣ аллакай миқдори назарраси димер мавҷуд аст. Қимати сеюм, тақрибан 73,460 M-1 cm-1 дар 664 nm, аз таҳқиқоте бо pH 6.86 ва 293 K гирифта шудааст, ки спектри мушоҳидашударо ба қисмҳои мономерӣ ва димерӣ ҷудо кардааст; ин таҳқиқот дар баррасии интиқодии нави фотофизикаи кабуди метиленӣ ҷамъбаст шудааст. Ин рақам ба ҷузъи мономерии бо деконволютсия ҷудошуда тааллуқ дорад, на ба нишебии мустақими абсорбанс нисбат ба миқдори умумии рангкунанда.

Нуктаи амалӣ чунин аст: коэффисиентеро интихоб кунед, ки шароиташ ба намунаҳои шумо мувофиқ бошад, ё худатон калибркунӣ гузаронед. Қимати 82,000-ро ба таҳлиле дар буфери фосфатӣ бо консентратсияи 30 micromolar ворид карда, фарз накунед, ки вобастагӣ ҳамоно хаттӣ мемонад.

Китфи кӯтоҳмавҷ натиҷаи омехта аст

Бо зиёд шудани консентратсия китфи наздики 600 то 615 nm нисбат ба қуллаи 664 nm меафзояд. Таҳқиқоти муосир одатан саҳми димери навъи H-ро наздики 605 то 610 nm ҷойгир мекунанд. Таҳлили умумии спектрии кабуди метиленӣ дар об максимуми димерро дар 607 nm ва максимуми агрегати дараҷаи баландтарро дар 600 nm ҷудо мекунад; ҷузъҳои резонансии мономер дар 664 ва 650 nm ҷойгиранд. Матни пурраи он тавассути сабти дастрасии озод барои PMID 33251415 дастрас аст.

Ин китфро набояд ҳамчун абсорбанси танҳо димер нишон дод. Сохтори вибронии мономер низ дар ҳамин минтақа саҳм мегузорад, бинобар ин баландии ченшуда натиҷаи рӯйҳамшавии чанд саҳм аст. Як мувофиқсозии умумии модел нишон дод, ки модели мономер ва димер дар тамоми фосилаи 1.1 micromolar то 3.4 millimolar мувофиқ нест, дар ҳоле ки илова кардани тетрамер беҳтарин мувофиқатро дод; сигнали тетрамер ҳатто дар консентратсияи камтар аз 34 micromolar ошкор мешуд. Қиматҳои шиддати ҷузъҳои мувофиқшуда калон буданд: тақрибан 107,800 M-1 cm-1 дар 664 nm барои ҷузъи асосии мономерӣ, тақрибан 101,400 барои димер дар 607 nm ва тақрибан 138,500 барои тетрамер дар 600 nm. Ин натиҷаҳо дар оби деионидашудаи бебуфер, бо хлориди натрий аз 0 то 0.15 M ва ҳарорат аз 282 то 333 K гирифта шудаанд. Инҳо қисмҳое мебошанд, ки бо модел ҷудо карда шудаанд, бинобар ин онҳоро набояд ба ҷойи нишебии таҷрибавии Бер–Ламберт истифода бурд.

Қувваи димершавӣ бевосита миқдоран муайян шудааст. Дар pH 6.86 ва 293 K як таҳқиқот собитаи димершавии наздики 3,900 M-1-ро ба даст овард. Ин бузургӣ мефаҳмонад, ки чаро маҳлули кории 5 micromolar қариб хаттӣ рафтор мекунад, вале маҳлули захиравии 50 micromolar чунин нест. Ҳангоми таҳияи усул санҷиши муфид таносуби абсорбанс дар наздикии 610 nm ба абсорбанс дар наздикии 665 nm мебошад. Агар ин таносуб бо зиёд шудани консентратсия боло равад, эпсилон дар 664 nm дигар як навъи тағйирнопазирро тавсиф намекунад.

Дар фосилаи консентратсияе, ки дар он як ҷуфти шаклҳои ба ҳам табдилшаванда бартарӣ дорад, спектрҳо метавонанд нуқтаи умумии изосбестикӣ дошта бошанд; дар силсилаҳои обӣ он таҷрибавӣ наздики 625 nm мушоҳида мешавад. Нуқтаи равшани собит ба мавҷудияти ду навъи асосӣ мувофиқ аст. Агар бо зиёд шудани консентратсия ин нуқта ҷой иваз кунад ё нопадид шавад, онро нишонаи пайдо шудани агрегатҳои дараҷаи баландтар ё тағйир ёфтани мувозинатҳо донед, на хатои асбоб.

Ҳалкунанда, pH ва ҳарорат спектрро тағйир медиҳанд

Об ба ассотсиатсия мусоидат мекунад. Мувофиқи таҳқиқоти таъсири ҳалкунанда ба кабуди метиленӣ дар омехтаҳои об ва DMSO, ки бо PMID 30933781 индексгузорӣ шудааст, илова кардани диметилсулфоксид димершавиро маҳдуд мекунад, максимумҳои ҷаббиш ва флуорессенсияро ба дарозии мавҷи бештар мекӯчонад ва ҳосили квантии флуорессенсияро тақрибан чор баробар зиёд мекунад. Ин таҳқиқот спектрҳои обиро ҳамчун мувозинати мономер–димер баррасӣ мекунад, ки абсорбанси мономер наздики 650 то 670 nm ва абсорбанси димер наздики 580 то 615 nm ҷойгир аст; собитаҳои димершавӣ аз спектрҳо дар 293.15 K ҳисоб карда мешаванд.

Спиртҳо ҳам мавқеъ ва ҳам шиддати зоҳириро тағйир медиҳанд, аммо агрегатшавиро бартараф намекунанд. Дар як муқоисаи ибтидоӣ бо консентратсияи 31.3 micromolar ва ҳарорати хона, ки дар таҳқиқоти ҳалкунандаҳои кабуди метиленӣ гузориш шудааст, максимуми дарозмавҷ дар об 665 nm, вале дар метанол 655 nm буд; қиматҳои зоҳирӣ барои тамоми маҳлул дар об наздики 37,100 ва дар метанол 60,800 буданд. Санҷиши ҷудогона дар этаноли мутлақ дар 298 K максимумро дар 655 nm ва эпсилонро наздики 68,000 нишон дод.

Тағйироти маъмулии pH спектрро назар ба он чи бисёр протоколҳо фарз мекунанд, камтар мекӯчонанд. Баррасии интиқодии дар боло зикршуда гузориш медиҳад, ки аз тақрибан pH 2 то pH 12 максимум наздики 665 nm боқӣ мондааст ва то pH 11 танҳо тағйироти хурди шиддат мушоҳида шудааст. Навъи буфер ва қувваи ионӣ метавонанд натиҷаҳоро ба андозаи pH-и номиналӣ тағйир диҳанд, бинобар ин буфер ва намаки воқеан истифодашударо сабт кунед, на танҳо нишондоди pH-метрро. Кислотаи қавӣ ё ишқори қавӣ ҳолати ҷудогона аст, зеро рангкунанда метавонад ба ҷойи ассотсиатсияи баргарданда тағйироти кимиёвӣ гузарад. Ҳарорат ва намак низ мувозинатро тағйир медиҳанд; аз ҳамин сабаб дар таҳқиқоти обии соли 2020 ҳар ду омил қасдан тағйир дода шуданд.

Ченкунӣ барои нигоҳ доштани эътибори қимат

Кори миқдорӣ ба муносибати Бер–Ламберт такя мекунад: абсорбанс ба ҳосили зарби эпсилон, консентратсия ва дарозии роҳи оптикӣ баробар аст. Ҳамчунин бояд исбот шавад, ки фосилаи хаттӣ дар шароити шумо воқеан нигоҳ дошта мешавад.

Барои кор бо консентратсияҳои пасти micromolar кюветаи 1 cm-ро истифода баред. Бо эпсилони наздики 82,000, консентратсияи 5 micromolar абсорбанси наздики 0.41 ва 10 micromolar тақрибан 0.82 медиҳад. Барои ченкуние, ки ба мономер дар оби одӣ равона шудааст, нигоҳ доштани консентратсия наздики ё камтар аз тақрибан 5 то 7 micromolar аз калибркунӣ дар даҳҳо micromolar бехатартар аст. Барои маҳлулҳои захиравии консентронидашуда, ба ҷойи қабул кардани абсорбанси хеле болотар аз 1, роҳи оптикиро кӯтоҳ кунед.

Барои намунаи холӣ матритсаи айнан якхеларо истифода баред: ҳамон дараҷаи сифати об, ҳамон ҳиссаи ҳалкунандаи иловагӣ, ҳамон буфер ва намакҳо, вале бе рангкунанда. Стандартҳои калибркуниро дар ҳамин матритса ва дар ҳамон ҳарорат омода кунед. Ҳангоми таҳияи усул тамоми фосилаи намоёни спектрро, беҳтараш тақрибан 550 то 750 nm, скан кунед, на ин ки танҳо як дарозии мавҷро хонед. Шаклро пайгирӣ кунед, на танҳо баландиро. Агар тунуккунии пайдарпай шакли нормалкардашударо тағйир диҳад, низом аз ҷиҳати кимиёвӣ ба консентратсия вобаста аст. Максимуми устувор ва таносуби устувори 610 ба 665 nm барои қобили қабул будани фосила назар ба танҳо R-и квадратии баланд далели қавитар мебошанд.

Шакли реагентро ҳуҷҷатгузорӣ кунед. Маводи тиҷоратӣ метавонад хлориди метилтионинии беоб ё гидрат, масалан тригидрат, бошад. Аз ин рӯ, массаи молярие, ки барои ҳисобҳои маҳлули захиравӣ истифода мешавад, бояд ба маводи воқеии дохили зарф мувофиқ бошад. Танҳо ҳамин қадам як қисми ихтилофи консентратсияҳои молярии номиналиро байни озмоишгоҳҳо шарҳ медиҳад. Ҳамин дақиқкорӣ ҳангоми истифодаи натиҷаҳо дар ҳисобҳои таҳлили миқдорӣ, ҳангоми истифодаи спектрҳо барои санҷиши устувории таркиб ва ҳангоми зарурати баррасии тозагӣ ва мушаххасоти сифат аз рӯйи профилҳои омехтаҳои бегона низ лозим аст.

Хулоса бо нишон додани шароит

Ин ҷадвалро ҳамчун қолаби ибтидоӣ барои сабти озмоишгоҳӣ истифода баред, на ҳамчун манбаи собитаҳои ивазшаванда.

Пас, дарозии мавҷи ҷаббиши кабуди метиленӣ ҷавоби кӯтоҳест, ки тавзеҳи дароз талаб мекунад. Қуллаеро гузориш диҳед, ки чен кардаед, дар ҳамон маҳлул ва бо ҳамон консентратсияе, ки чен кардаед. Ин одат намегузорад, ки як қимат барои маҳлули тунуки обӣ наздики 664 nm ба собитаи умумии бардурӯғ табдил ёбад.