मिथिलीन ब्लू आणि Bartonella: प्रयोगशाळेतील निष्कर्ष आणि चिकित्सीय पुराव्यांच्या मर्यादा

कल्चर डिश आणि रुग्ण या दोन्ही संदर्भांत ‘संसर्ग’ हा शब्द वापरला जातो, पण त्याचा अर्थ एकसारखा नसतो. डिशमध्ये संसर्ग म्हणजे आगरवरील वसाहतींची संख्या. रुग्णामध्ये मात्र पेशी आणि रक्तवाहिन्यांतील जीवाणू, रक्त व ऊतकांमधून प्रवास करणारी औषधे आणि कामाचा काही भाग करणारी रोगप्रतिकारक यंत्रणा यांचा समावेश असतो. या दोन्हींची गल्लत केली तर प्रयोगशाळेतील एखादा लक्षवेधी आकडा उपचारासारखा वाटू लागतो. त्यांना वेगळे ठेवले तर तोच आकडा त्याच्या योग्य स्वरूपात दिसतो: पुढचा प्रयोग करण्याचे एक कारण.

मिथिलीन ब्लू आणि Bartonella यांवरील या आढाव्याचा मुख्य उद्देश हाच फरक स्पष्ट ठेवणे आहे. एका संशोधन गटाच्या दोन प्रयोगशाळीय अभ्यासांनी वाढ थांबलेल्या अवस्थेतील Bartonella henselae विरुद्ध मिथिलीन ब्लूची चाचणी केली. दोन्ही अभ्यासांत काचेच्या आणि प्लास्टिकच्या प्रयोगशाळीय भांड्यांमध्ये ठळक क्रियाशीलता आढळली. कोणत्याही अभ्यासात माणसावर चाचणी केली नाही.

संशोधक स्थिर अवस्थेची चाचणी का करतात

बहुतेक प्रतिजैविक चाचण्यांमध्ये वाढणाऱ्या पेशी वापरल्या जातात. त्या प्रतिमानात एक अधिक कठीण परिस्थिती विचारात घेतली जात नाही: विभाजन थांबलेल्या अशा पेशी, ज्या त्यांच्या वाढणाऱ्या समकक्ष पेशींना मारणारी औषधे सहन करतात.

Bartonella शरीरात टिकून राहू शकते; यात लाल रक्तपेशी आणि रक्तवाहिन्यांच्या आतील अस्तराच्या पेशींचाही समावेश आहे. त्यामुळे B. henselae स्थिर अवस्थेत गेल्यावर कोणती मंजूर औषधे त्याला मारू शकतात, असा प्रश्न या गटाने विचारला. वाढणाऱ्या पेशींविरुद्ध कमी MIC असल्याने स्थिर अवस्थेतील पेशी नष्ट होतील, असे भाकीत करता आले नाही. रिफॅम्पिनचे MIC खूप कमी होते, तरी स्थिर पेशी नष्ट करण्याची त्याची क्षमता कमी होती; उलट, जास्त MIC असलेल्या संयुगांनी त्या चांगल्या प्रकारे नष्ट केल्या. अशा प्रकारचे संशोधनपत्र वाचण्याची सर्वसाधारण पद्धत हवी असलेल्या वाचकांना ती मिथिलीन ब्लूवरील संशोधन वाचण्याच्या मार्गदर्शकात मिळेल.

पहिली छाननी: Li आणि सहकारी, 2019

Antibiotics मधील 2019 ची स्थिर-अवस्था छाननी या अभ्यासात B. henselae JK53 हा एकच स्ट्रेन वापरला गेला. तो 10 percent भ्रूणीय गोवंशीय सीरम असलेल्या Schneider माध्यमात, 37 C तापमानाला आणि 5 percent CO2 असलेल्या वातावरणात वाढवला गेला. एक दिवसाच्या कल्चरमध्ये बहुतांश पेशी विखुरलेल्या आणि विभाजित होणाऱ्या होत्या. पाच दिवसांच्या कल्चरमध्ये प्रति mL सुमारे 10 to the 8th वसाहत निर्माण करणारी एकके होती; त्यांना स्थिर अवस्थेतील कल्चर मानले गेले आणि त्यात दिसणारे पेशीसमूह होते.

चाचणीत प्रोपिडियम आयोडाइडसह SYBR Green I वापरले गेले. जिवंत पेशी आणि आयसोप्रोपानॉलने मारलेल्या पेशी यांच्या मिश्रणांच्या आधारे तिचे अंशांकन केले होते. मिथिलीन ब्लूचा रंग तीव्र असल्यामुळे प्राथमिक चाचणीत सकारात्मक आढळलेल्या निष्कर्षांची सूक्ष्मदर्शकाने खातरजमा केली गेली. त्यानंतर अधिक कठोर निकष असलेल्या ब्लड आगरवरील वसाहतींच्या मोजणीने पडताळणी केली गेली.

50 micromolar सांद्रतेवर तपासलेल्या 1,581 मंजूर औषधांपैकी मिथिलीन ब्लू वापरल्यावर प्लेट रीडरनुसार 16 percent आणि सूक्ष्मदर्शकानुसार 25 percent पेशी जिवंत राहिल्या. डॅप्टोमायसिनसाठी हे प्रमाण 21 percent, अनेक अझोल औषधांसाठी 22 ते 27 percent, जेन्टामायसिनसाठी 32 percent, एरिथ्रोमायसिनसाठी 66 percent आणि सिप्रोफ्लॉक्सासिनसाठी 74 percent होते. प्लेट रीडरवर पिर्विनियम पॅमोएट अधिक प्रभावी वाटले, पण त्याच्या स्वतःच्या प्रतिदीप्तीमुळे सूक्ष्मदर्शकाने त्याचे मूल्यांकन करता आले नाही.

वाढणाऱ्या B. henselae विरुद्ध मिथिलीन ब्लूचे MIC 0.08 ते 0.16 micrograms per mL होते. पाच दिवसांच्या स्थिर पेशींवर 5 micrograms per mL सांद्रतेने एक दिवस संपर्क ठेवल्यानंतर, शोधता येतील अशा कोणत्याही वसाहती उरल्या नाहीत. त्यांच्या तपासलेल्या सांद्रतेवर डॅप्टोमायसिन आणि पिर्विनियम पॅमोएटचे निष्कर्षही असेच होते. वेळेनुसार पेशी नष्ट होण्याची स्वतंत्र चाचणी 10 micrograms per mL सांद्रतेवर केली गेली. ही प्रयोगशाळेतील संपर्क-सांद्रता आहे, औषधाची मात्रा नव्हे; संशोधनपत्रातही ती तशीच नमूद केली आहे. मानवातील कमाल प्लाझ्मा सांद्रतेचा संदर्भित आकडा, सुमारे 3.9 micrograms per mL, संशोधनपत्रात केवळ पार्श्वभूमीच्या संदर्भासाठी दिला आहे. प्लाझ्मातील आकडा म्हणजे ऊतकांतील आकडा का नव्हे, हे मिथिलीन ब्लूच्या औषधगतिकीच्या आढाव्यात स्पष्ट केले आहे.

संशोधनपत्रात दोन मर्यादा स्पष्टपणे नमूद आहेत. जैवपटाचे प्रतिमान नव्हते आणि मिथिलीन ब्लूच्या औषध-संयोगांची चाचणीही नव्हती. पाच दिवसांनी दिसलेले पेशीसमूह हे स्थिर अवस्थेतील द्रव कल्चरमधील समूह होते; ते प्रमाणित जैवपट प्रयोग नव्हते. लेखकांनी प्राण्यांवरील अभ्यास, औषध-संयोगांचे अभ्यास, जैवपटावरील अभ्यास आणि Bartonella च्या इतर प्रजातींवरील चाचण्यांची गरज मांडली.

औषध-संयोग आणि जैवपटातून मिळवलेल्या पेशी: Zheng आणि सहकारी, 2020

BMC Microbiology मधील 2020 च्या पुढील अभ्यासात तोच स्ट्रेन आणि तेच माध्यम वापरले गेले, पण सहा दिवसांच्या स्थिर कल्चरकडे वळून पहिल्या संशोधनपत्रात नसलेल्या दोन गोष्टी जोडल्या गेल्या: दोन औषधांचे संयोग आणि जैवपटातून मिळवलेल्या पेशींचे प्रतिमान.

एकेक औषध 5 micrograms per mL या समान सांद्रतेवर 24 hours वापरल्यावर, मिथिलीन ब्लूनंतर प्रति mL 3.2 times 10 to the 4th वसाहत निर्माण करणारी एकके उरली; तुलनेसाठीच्या नियंत्रण गटात हे प्रमाण सुमारे 2.8 times 10 to the 10th होते. त्याच वेळी सिप्रोफ्लॉक्सासिन, जेन्टामायसिन आणि नायट्रोफ्युरँटोइननंतर त्यापेक्षा कमी वसाहती उरल्या. हा निष्कर्ष 2019 च्या निष्कर्षापेक्षा वेगळा आहे: त्या अभ्यासात त्याच नाममात्र सांद्रतेवर एका दिवसानंतर शोधता येतील अशा वसाहती उरल्या नव्हत्या. कल्चरचे वय, घनता आणि हाताळणी वेगळी होती. त्यामुळे पेशी नष्ट होण्याचा कल पुनरुत्पादित झाला, पण त्याचे प्रमाण तंतोतंत सारखे नव्हते. चाचण्यांमधील हा फरक हे एक कारण आहे की नियमित सुरक्षितता आणि औषध-परस्परक्रिया तपासण्यांमध्ये प्रयोगशाळेतील सामर्थ्य आणि चिकित्सीय परिणाम वेगळे मानले जातात.

औषध-संयोगांची छाननी हा सर्वाधिक उद्धृत होणारा भाग आहे. प्रत्येक घटकाची सांद्रता 5 micrograms per mL निश्चित ठेवली होती. अझिथ्रोमायसिन अधिक मिथिलीन ब्लू आणि रिफॅम्पिन अधिक मिथिलीन ब्लू या दोन्ही संयोगांनंतर 24 hours ने स्थिर अवस्थेतील शोधता येतील अशा वसाहती उरल्या नाहीत. सिप्रोफ्लॉक्सासिन असलेल्या दोन्ही जोड्यांमध्येही हाच निष्कर्ष मिळाला; तपासलेल्या 25 जोड्यांपैकी फक्त या चार जोड्यांमध्ये असे झाले. सहक्रियेचे कोणतेही औपचारिक विश्लेषण केले गेले नाही. म्हणून योग्य वर्णन म्हणजे या परिस्थितीत क्रियाशील असलेला संयोग, सिद्ध झालेली सहक्रिया नव्हे.

जैवपटाच्या प्रयोगात नुकत्याच तयार झालेल्या आणि विघटित केलेल्या जैवपटातून मिळवलेल्या पेशी तपासल्या गेल्या; अखंड, परिपक्व जैवपटात औषधाचा प्रवेश तपासला गेला नाही. कल्चर पाच दिवस वाढवले गेले, विरळ करून वेल प्लेटमध्ये आणखी पाच दिवस ठेवले गेले, क्रिस्टल व्हायोलेट रंगवण्याच्या पद्धतीने खातरजमा केली गेली आणि नंतर औषधाचा संपर्क देण्यापूर्वी खरवडून काढले गेले. 5 micrograms per mL सांद्रतेवर फक्त मिथिलीन ब्लू वापरल्यावर 6 व्या दिवशी वसाहत निर्माण करणाऱ्या एककांची संख्या 2.3 times 10 to the 2nd पर्यंत कमी झाली. एकेकट्या वापरलेल्या औषधांपैकी हा सर्वोत्तम निष्कर्षांपैकी एक होता, पण तो शून्य नव्हता. मिथिलीन ब्लूच्या दोन्ही संयोगांनी 6 व्या दिवसापर्यंत शून्य गाठले; सिप्रोफ्लॉक्सासिनच्या दोन्ही संयोगांनीही तसेच केले.

काळजीपूर्वक वाचणाऱ्या वाचकाला जाणवतील त्याच मर्यादा लेखकांनी नमूद केल्या: जुना अखंड जैवपट वापरण्याऐवजी नुकताच तयार झालेला जैवपट खरवडून वापरला; प्रत्येक औषधाची स्वतःची वास्तववादी कमाल सांद्रता वापरण्याऐवजी सर्वांसाठी सोयीची एकच सांद्रता वापरली; अझिथ्रोमायसिन किंवा रिफॅम्पिन केंद्रस्थानी असलेल्या काही निवडक जोड्याच तपासल्या; एकच स्ट्रेन वापरला; प्राण्यांवर किंवा रुग्णांवर चाचण्या केल्या नाहीत. पुढे तीन औषधांच्या संयोगांचा अभ्यास सुचवला गेला होता, त्याचे निष्कर्ष नोंदवले नव्हते.

अभ्यासांच्या आराखड्यांची तुलना

हा तक्ता म्हणजे या लेखाचा मुख्य मुद्दा संक्षिप्त स्वरूपात आहे. शेवटच्या स्तंभाच्या डावीकडील सर्व काही कल्चरवरील काम आहे. दोन्ही संशोधनपत्रांतील कोणतीही गोष्ट शेवटच्या स्तंभात बसत नाही.

Bartonella म्हणजे Borrelia नव्हे

दोन्ही संशोधनपत्रांत Lyme रोगाशी संबंधित सर्पिलाकार जीवाणू Borrelia burgdorferi चा उल्लेख आहे. कारण रंगद्रव्यावर आधारित चाचणी त्याच प्रयोगशाळेतील स्थिर अवस्थेच्या Borrelia वरील आधीच्या कामातून आली होती. त्या कामात मिथिलीन ब्लू आणि डॅप्टोमायसिन यांनाही प्राथमिक चाचणीत सकारात्मक निष्कर्ष मिळाले होते. हा इतिहास संदर्भ समजण्यासाठी उपयुक्त आहे, पण चुका होण्याचे एक सामान्य कारणही आहे.

Bartonella वरील दोन्ही संशोधनपत्रांतील कोणत्याही प्रयोगात Borrelia आणि Bartonella यांची समांतर चाचणी केलेली नाही. जीव वेगळे आहेत, माध्यमे वेगळी आहेत, सांद्रता वेगळी आहे आणि Bartonella मध्ये मिथिलीन ब्लूचा पेशीपटलावर होणारा प्रस्तावित परिणाम हा अधिक अभ्यासाची गरज असलेला अंदाज म्हणून मांडला होता. एका प्रजातीतील निष्कर्ष दुसऱ्या प्रजातीला लागू करू नयेत आणि कोणतेही संशोधनपत्र परजीवींबद्दल व्यापक दाव्यांना आधार देत नाही. याच कारणामुळे Borrelia आणि Bartonella मधील टिकून राहणाऱ्या पेशींची तुलना या दोन्हींचे संशोधनसाहित्य वेगळे ठेवते.

कल्चरमधील निष्कर्षांचे उपचारपद्धतीत रूपांतर का होत नाही

मिथिलीन ब्लू आणि Bartonella साठी उपचारपद्धती शोधण्याची उत्सुकता समजण्यासारखी आहे. मात्र या संशोधनपत्रांमुळेच अशा शब्दप्रयोगाकडे खरेदीची यादी म्हणून नव्हे, तर सावधगिरीचा इशारा म्हणून पाहिले पाहिजे.

पहिले म्हणजे, वेलमधील 5 micrograms per mL ही सांद्रता म्हणजे औषधाचे प्रिस्क्रिप्शन नव्हे. त्यात शोषण, वितरण, प्रथिनांशी बंधन, पेशींच्या आतील प्रवेश किंवा सहनशीलता यांची माहिती समाविष्ट नाही. प्रतिजैविकांच्या कमाल सांद्रतांची ढोबळ सरासरी म्हणून लेखकांनी ती निवडली आणि पुढील अभ्यासांत प्रत्येक औषधाची स्वतःची वास्तववादी सांद्रता वापरली पाहिजे, असे सांगितले.

दुसरे म्हणजे, शून्य वसाहती याचा अर्थ त्या प्लेटवरील चाचणीच्या परिस्थितीत वसाहती आढळल्या नाहीत असा होतो; ऊतक जीवाणूमुक्त झाले असा नव्हे. टिकून राहणाऱ्या पेशी, पेशींच्या आतील जीवाणू आणि नमुना घेण्याच्या मर्यादा या सगळ्या गोष्टी आगर प्लेटच्या कक्षेबाहेर आहेत.

तिसरे म्हणजे, वेलमधील सर्व जीवाणू नष्ट करणारे संयोग शरीरात निष्फळ ठरू शकतात किंवा हानी पोहोचवू शकतात. अझिथ्रोमायसिन अधिक मिथिलीन ब्लू आणि रिफॅम्पिन अधिक मिथिलीन ब्लू या प्रयोगशाळेतील संपर्क-सांद्रतांवर तपासलेल्या प्रयोगशाळीय जोड्या आहेत. प्राण्यांतील औषधगतिकी आणि मानवांतील नियंत्रित अभ्यासांची माहिती नसल्यामुळे मात्रा, कालावधी किंवा लाभ-जोखीम गुणोत्तर निश्चित झालेले नाही. पर्यायांचा विचार करणाऱ्या कोणत्याही व्यक्तीने डॉक्टरांशी चर्चा करावी आणि डिशमधील माहितीवरून कोणताही निष्कर्ष काढण्यापूर्वी मिथिलीन ब्लूच्या वापरासाठी वैद्यकीय देखरेख कधी आवश्यक असते हे पाहावे.

ही संशोधनपत्रे ज्या मर्यादित निष्कर्षाला आधार देतात, तो असा आहे: मिथिलीन ब्लूची वाढ थांबलेल्या B. henselae JK53 विरुद्ध प्रयोगशाळेत पुनरुत्पादित करता येण्याजोगी क्रियाशीलता आहे. यात प्रयोगशाळेतील दोन औषधांच्या संयोगांचाही समावेश आहे; संयोग आणि जैवपटातून मिळवलेल्या पेशींवरील सर्वाधिक ठळक निष्कर्ष 2020 च्या अभ्यासातून आले आहेत. मानवांतील बार्टोनेलोसिससाठी या क्रियाशीलतेचे महत्त्व आहे का यासह बाकी सर्व बाबी अद्याप तपासलेल्या नाहीत.