Vai lielāks skābekļa patēriņš nozīmē vairāk ATP? Atziņas no metilēnzilā pētījumiem

Izolēts mitohondrijs atrodas kamerā ar enerģijas substrātu, bet bez ADP. Tas skābekli patērē lēni. Pievienojot ADP, skābekļa patēriņš pieaug vairākas reizes. Kad ADP ir izlietots, skābekļa patēriņš atkal samazinās. Enerģijas substrāts nav mainījies. Mainījies ir tikai pieprasījums pēc ATP.

Šī īsā notikumu secība ietver visu atšķirību, par kuru ir šis raksts. Skābekļa patēriņš raksturo, cik ātri elektroni caur elpošanas ķēdi nonāk līdz skābeklim. ATP veidošanās raksturo, cik liela šīs plūsmas daļa tiek uzkrāta izmantojamas enerģijas veidā. Abus procesus saista starpposms — protonu gradients pāri mitohondrija iekšējai membrānai. Viss, kas maina to, cik cieši šis gradients ir sajūgts ar ATP sintēzi, var mainīt abus galarezultātus dažādos virzienos. Metilēnzilais šeit ir noderīgs piemērs, jo novēroti abi varianti: dažos preparātos tas palielina skābekļa patēriņu līdz ar ATP, bet citos palielina skābekļa patēriņu, kamēr ATP līmenis nemainās vai samazinās.

Lasītāji, kuri vispirms vēlas plašāku priekšstatu par elektronu pārnesi, var sākt ar skaidrojumu par to, kā metilēnzilais pārnes elektronus elpošanas ķēdē. Savukārt tie, kuri vēlas iepazīt agrīno skābekļa patēriņa eksperimentu terminoloģiju, var izlasīt, ko patiesībā parādīja pirmie elpošanas mērījumi.

Elpošana, ATP un gradients starp tiem

Elektroni no NADH un FADH2 nonāk ķēdē caur I un II kompleksu, caur III kompleksu pāriet uz citohromu c un pēc tam caur IV kompleksu — uz skābekli. I, III un IV kompleksā atbrīvotā enerģija tiek izmantota protonu sūknēšanai no matriksa uz starpmembrānu telpu. Šī lādiņa un skābuma atšķirība veido protonu dzinējspēku, un tā elektriskā komponente — membrānas potenciāls — parasti ir dominējošā.

ATP sintāze ļauj protoniem plūst atpakaļ matriksā un izmanto atbrīvoto enerģiju, lai savienotu ADP un fosfātu, veidojot ATP. Tātad secība ir šāda:

skābekļa patēriņš, tad protonu sūknēšana, tad gradients, tad ATP sintēze.

Taču protoni var atgriezties arī pa citiem ceļiem. Jebkura atgriešanās, kas apiet ATP sintāzi, ir protonu noplūde. Noplūde liek ķēdei atkal sūknēt tos pašus protonus, lai saglabātu nemainīgu membrānas potenciālu. Tas palielina skābekļa patēriņu, neradot vairāk ATP. Pietiekami spēcīga noplūde izraisa atsaistīšanu: skābekļa patēriņš pieaug, kamēr ATP līmenis nemainās vai samazinās, un neizmantotā enerģija izdalās siltuma veidā.

3. stāvoklis, 4. stāvoklis un elpošanas kontroles attiecība

Klasiskā terminoloģija šajā jomā radusies izolētu mitohondriju pētījumos. 3. stāvoklis ir elpošana substrāta un ADP klātbūtnē: ATP sintāze samazina gradientu, membrānas potenciāls pazeminās, ķēde paātrinās, lai to atjaunotu, un skābekļa patēriņš ir liels, jo tiek veidots ATP. 4. stāvoklis ir elpošana pēc ADP izlietošanas: ATP sintāze vairs aktīvi nedarbojas, gradients palielinās, augstais membrānas potenciāls kavē turpmāku protonu sūknēšanu, un skābekļa patēriņš samazinās līdz līmenim, kas nepieciešams noplūdes kompensēšanai.

Tādēļ elpošanas kontroles attiecība — elpošanas ātrums 3. stāvoklī, dalīts ar elpošanas ātrumu 4. stāvoklī — raksturo, cik ciešs ir sajūgums preparātā. Augsta attiecība nozīmē, ka ADP spēcīgi kontrolē elpošanu. Attiecības samazināšanās līdz ar elpošanas pieaugumu 4. stāvoklī nozīmē, ka sāk dominēt noplūde. Šādi var izprast tālāk aprakstītos metilēnzilā pētījumu rezultātus.

Ir vērts paturēt prātā vienu modeli. Augsts membrānas potenciāls palēnina ķēdi. Potenciāla izkliedēšana to paātrina. Ķēde reaģē uz to, cik grūta kļuvusi protonu sūknēšana, nevis tieši uz to, vai tiek veidots ATP.

Kad galarezultāti mainās kopā

Skaidrākais sajūguma piemērs iegūts pētījumā ar izolētiem jūrascūciņu smadzeņu mitohondrijiem ar bloķētiem elpošanas ķēdes kompleksiem. Metilēnzilā koncentrācijā no 100 nanomolāriem līdz 1 mikromolāram skābekļa patēriņš miera stāvoklī palielinājās, izmantojot glutamātu kopā ar malātu, sukcinātu vai glicerofosfātu kā enerģijas substrātu, bet ADP stimulētā elpošana nemainījās. Mitohondrijos ar inhibētu I vai III kompleksu krāsviela nedaudz palielināja ATP veidošanos, atjaunoja membrānas potenciālu un uzlaboja kalcija uzņemšanu. Ierosinātais mehānisms ir apvedceļš: krāsviela pieņem elektronus pirms bloķētā posma un nodod tos citohromam c, apejot bojāto kompleksu.

Otrā gadījumā, kur rādītāji mainās kopā, tiek izmantots pavisam cits ATP avots. Izolētos smadzeņu mitohondrijos ar inhibētu ATP sintāzi metilēnzilais joprojām stimulēja elpošanu ar katru pārbaudīto substrātu. Taču ATP sintēze palielinājās tikai ar alfa-ketoglutarātu un glutamātu — abiem substrātiem, no kuriem veidojas sukcinil-CoA. Tā kā oligomicīns bloķēja ATP sintāzi, papildu ATP radās citronskābes ciklā, sukcinil-CoA ligāzei veicot fosforilēšanu substrāta līmenī, nevis oksidatīvajā fosforilēšanā. Krāsviela arī atjaunoja membrānas potenciālu, kad vienlaikus tika inhibēts I komplekss un ATP sintāze. Šeit skābekļa patēriņš un ATP mainījās kopā, bet tikai tad, ja substrāts ļāva darboties otrajam ATP veidošanās ceļam. Ar sukcinātu vai malātu elpošana palielinājās, bet papildu ATP neveidojās. Tā pati krāsviela, tā pati kamera, cits enerģijas substrāts, cits rezultāts.

Kad galarezultātu izmaiņas atšķiras

Arī gadījumi, kuros rādītāju izmaiņas atšķiras, ir publicēti un tikpat pamācoši. 1997. gada pētījumā ar izolētiem žurku aknu mitohondrijiem metilēnzilais paātrināja elpošanu 4. stāvoklī cieši sajūgtos mitohondrijos, kas elpošanai izmantoja sukcinātu, tādējādi samazinot elpošanas kontroles attiecību. Ietekme bija novērojama jau 0.5 mikromolārā koncentrācijā un bija izteikta 5 mikromolārā koncentrācijā, kas ir tuva koncentrācijai plazmā pēc 100 miligramu intravenozas bolus injekcijas. 5 mikromolārā koncentrācijā mitohondriji arī uzbrieda, taču sajūguma traucējumi vispirms parādījās zemākās koncentrācijās. Tas liecina, ka noplūde radās pirms strukturālajiem bojājumiem, nevis to dēļ. Atsaistītos mitohondrijos krāsviela stimulēja elpošanu no koncentrācijas atkarīgā veidā, sasniedzot piesātinājumu. Skābekļa patēriņš palielinājās abos preparātos. ATP sintēze uz patērētā skābekļa daudzumu nepalielinājās. Tas ir klasisks atsaistīšanas un elektronu pārneses piemērs vienā un tajā pašā molekulā.

Visizteiktākā atšķirība novērota tīklenē. Pelēm ar AIF deficītu un ar rotenonu apstrādātās fotoreceptoru šūnās metilēnzilais saglabāja tīklenes biezumu, fotoreceptoru marķierus un mitohondriju struktūru, samazināja NADH attiecību pret NAD un mazināja stresa signālceļu aktivitāti, tostarp atbildes reakciju uz nesalocītiem proteīniem un mitofāgiju. Tas notika, nenovēršot ATP trūkumu. Aizsardzība bez enerģijas atjaunošanas nozīmē, ka ieguvumu nodrošināja oksidēšanās–reducēšanās līdzsvars un mitohondriju integritāte, nevis papildu ATP. Ikviens, kurš audu izdzīvošanu pielīdzinātu atjaunotai enerģijas ražošanai, šo eksperimentu izprastu pilnīgi nepareizi.

Pētījumi ar smadzeņu mitohondrijiem šai pašai ainai pievieno arī izmaksu pusi. Tās pašas zemās koncentrācijas, kas uzlaboja bioenerģētiku, visos pārbaudītajos apstākļos arī palielināja ūdeņraža peroksīda veidošanos un palēnināja tā izvadīšanu. To mērīja ar kalibrētu Amplex testu, nevis nespecifisku krāsvielu. Vairāk ATP un vairāk oksidanta radās vienlaikus.

Praktisks kontrolsaraksts pētījumu lasīšanai

Četri jautājumi palīdz atšķirt sajūgtu rezultātu no atsaistīta.

Pirmkārt, kurš galarezultāta rādītājs patiesībā tika mērīts. Skābekļa patēriņš vien nevar raksturot ATP. ATP sintēze, membrānas potenciāls un elpošanas kontroles attiecība katrs sniedz informāciju, ko skābekļa elektrods nevar parādīt. Ceļvedis metilēnzilā pētījumu apgalvojumu lasīšanai detalizēti izskaidro šo rūpīgo pieeju galarezultāta rādītājiem.

Otrkārt, kurš substrāts nodrošināja mitohondrijus ar enerģiju. Sukcinil-CoA rezultāts parāda, ka enerģijas substrāta izvēle var noteikt, vai papildu elpošana vispār var radīt papildu ATP.

Treškārt, kāda koncentrācija tika izmantota. Metilēnzilais nanomolārās līdz zemās mikromolārās koncentrācijās smadzeņu mitohondrijos deva nelielus bioenerģētikas uzlabojumus kopā ar oksidantu pieaugumu; pusmikromolāra un augstāka koncentrācija aknu mitohondrijos vājināja sajūgumu; 5 mikromolārā koncentrācijā papildus radās uzbriešana. Koncentrācija ir daļa no mehānisma, nevis fona detaļa.

Ceturtkārt, kurā modelī rezultāts tika iegūts. Izolēti mitohondriji atklāj mehānismu savienojumus, bet neskartās šūnās un audos papildus darbojas transports, reducēšana līdz bezkrāsainajai formai un konkurējoši elektronu pieņēmēji. Laboratorijas pētījumi par izmantotajiem daudzumiem, tostarp par to, kā koncentrācija un protokols ietekmē metilēnzilā darbību, ir saikne starp kamerā iegūtajiem skaitļiem un jebkuru apgalvojumu par cilvēku.

Skābekļa patēriņš raksturo elektronu plūsmu. ATP raksturo, cik liela šīs plūsmas daļa tika uzkrāta. Metilēnzilais var mainīt jebkuru no tiem, un iepriekš aprakstītie eksperimenti parāda visas četras izrietošās kombinācijas: abi palielinās; elpošana palielinās, bet ATP — tikai tad, ja substrāts to ļauj; elpošana palielinās, kamēr sajūgums vājinās; un audi saglabājas, kamēr ATP līmenis nemainās. Skābekļa elektroda rādījums ir interpretācijas sākums, nevis tās beigas.