Metilēnzilais insulta un smadzeņu hipoperfūzijas pētījumos: ko patiesībā parāda trīs modeļi

Nosprostota artērija, šūnu kultūra bez barības vielām un žurka ar sašaurinātām kakla artērijām izklausās pēc viena eksperimenta trim variantiem. Taču tā nav. Katrs no tiem uzdod atšķirīgu jautājumu, un metilēnzilais katrā sniedz atšķirīgu atbildi. Ja tos sajauc, zinātniskā literatūra šķiet pretrunīga. Ja tos nodala, atklājas skaidra likumsakarība, ko galvenokārt nosaka ievadīšanas laiks.

Šī nošķiršana ir visa pārskata būtība. Trīs modeļi ir akūts fokāls insults, skābekļa un glikozes trūkums ar sekojošu reoksigenāciju kultivētās šūnās un hroniska smadzeņu hipoperfūzija vairāku nedēļu garumā. Iespējamais mehānisms, kas tos saista, ir mitohondriāls, taču rezultāti atšķiras, jo atšķiras vielmaiņas apstākļi.

Trīs modeļi atbild uz atšķirīgiem jautājumiem

Akūtu fokālu insultu žurkām parasti izraisa, nosprostojot vidējo smadzeņu artēriju; šo metodi saīsināti apzīmē kā MCAO. Tromba radītam nosprostojumam līdzīgs aizsprostojums veido išēmisku kodolu, ko ieskauj penumbra — apdraudēti audi, kurus potenciāli vēl var glābt, ja asins plūsma atjaunojas. Šeit jautājums ir par to, vai iejaukšanās palēnina infarkta paplašināšanos vai saglabā funkciju reperfūzijas laikā.

Skābekļa un glikozes trūkuma modelis, ko saīsināti apzīmē kā OGD, darbojas pilnīgi citā mērogā. Kultivētas smadzeņu šūnas ievieto vidē ar gandrīz nulles skābekļa līmeni un bez glikozes, pēc tam atgriež normālā barotnē. Tajā nav tromba, kolaterālās asinsrites, asinsspiediena vai imūnsistēmas. Jautājums attiecas tikai uz šūnām: kas notiek ar šūnu elpošanu, ATP un izdzīvošanu, kad substrāti pazūd un pēc tam atkal kļūst pieejami.

Hroniskas smadzeņu hipoperfūzijas pētījumos žurkām izmanto pastāvīgu abu miega artēriju nosprostošanu, ko sauc par 2VO modeli. Asins plūsma uz priekšsmadzenēm samazinās un saglabājas zema vairākas nedēļas. Nav pēkšņa fokāla infarkta un nav neatliekamas reperfūzijas. Jautājums ir par to, vai vairākas nedēļas ilgs vielmaiņas atbalsts saglabā asinsvadus, mitohondrijus un atmiņu ilgstoši samazinātas asins plūsmas apstākļos.

Tāpēc atmiņas uzlabošanās pēc viena mēneša ārstēšanas 2VO modelī tieši neko nepasaka par cilvēka smadzeņu glābšanu neatliekamas trombektomijas laikā. Šī atšķirība ir svarīga, jo lielākā daļa optimistisko kopsavilkumu to izlaiž.

Akūts insults: aizsardzība reperfūzijas laikā, aizkavēšana bez tās

Skaidrākais akūtais rezultāts iegūts pārejošas MCAO modelī ar reperfūziju. Žurkām artērija bija nosprostota 60 minūtes, pēc tam, sākoties reperfūzijai, intravenozi ievadīja nelielu metilēnzilā devu, bet papildu devas ievadīja pēc 3 stundām un 2. dienā. Magnētiskās rezonanses attēli parādīja, ka nesējvielas grupā bojājums līdz 2. dienai palielinājās par aptuveni 19 procentiem, savukārt ārstētajā grupā tas samazinājās par aptuveni 17 procentiem; galīgais infarkta apjoms bija aptuveni par 30 procentiem mazāks, un neiroloģiskie rādītāji 2. un 7. dienā bija labāki. Attēldiagnostika uzrādīja uzlabotu audu izdzīvošanu gan kodolā, gan penumbrā. Plašākā literatūra par neiroprotekciju šo ar reperfūzijas laiku saistīto aizsardzību aplūko līdzās globālās išēmijas un traumu pētījumu rezultātiem.

Aina mainās, ja artērija paliek nosprostota. Pastāvīgas MCAO eksperimentā metilēnzilais, ko ievadīja turpinošās išēmijas laikā, palēnināja difūzijas attēlos redzamā bojājuma paplašināšanos un uz īsu brīdi pagarināja perfūzijas un difūzijas neatbilstības periodu, nedaudz uzlabojot lokālo asins plūsmu, taču galīgais infarkta tilpums pēc 24 stundām būtiski neatšķīrās. Tas aizkavēja apdraudēto audu pāreju uz neatgriezenisku bojājumu, bet neaizstāja asinsvada atvēršanu.

Trešais akūtais pētījums sniedz papildu ieskatu mehānismā un devas nozīmē. Vienreizēja intraperitoneāla deva tūlīt pēc nosprostošanas uzrādīja lielāko infarkta samazinājumu — aptuveni 50 procentus — pie vidējās 5 mg/kg devas, nevis pie 1 vai 10 mg/kg, un arī sensomotorie rādītāji bija labāki. Autori to saistīja ar saglabātu mitohondriju struktūru un pastiprinātu mitofāgiju — selektīvu bojāto mitohondriju noārdīšanu. Tātad nozīme ir devai, ievadīšanas veidam un shēmai, un žurkām izmantotās mg/kg vērtības nav insulta ārstēšanas devas cilvēkiem.

Šūnu kultūra: tas pats līdzeklis palīdz vai kaitē atkarībā no ievadīšanas laika

Eksperiments ar astrocītiem ir vispamācošākais un visbiežāk nepareizi citētais. Primāros peļu smadzeņu garozas astrocītus 6 stundas pakļāva izteiktam skābekļa un barības vielu trūkumam barotnē ar 0.1 procentu skābekļa, bez glikozes, piruvāta un seruma, pēc tam 24 stundas veica reoksigenāciju, atjaunojot substrātu pieejamību. Aptuveni puse šūnu gāja bojā, tāpēc šis tests ļāva konstatēt gan labvēlīgu, gan nelabvēlīgu ietekmi.

Ja metilēnzilais bija klātesošs trūkuma fāzē, izdzīvošana pasliktinājās, nevis uzlabojās. Savukārt, ja to pievienoja reoksigenācijas sākumā, zemas mikromolāras koncentrācijas uzlaboja šūnu dzīvotspēju un palielināja skābekļa patēriņu, glikozes uzņemšanu un ATP veidošanos. Normālos apstākļos tās pašas koncentrācijas palielināja glikozes uzņemšanu par aptuveni 89 procentiem pie 0.1 mikromolāras koncentrācijas un par aptuveni 200 procentiem pie 1 mikromolāras koncentrācijas; pēc bojājuma saglabājās glikogēns un heksokināzes aktivitāte, un netika konstatēts superoksīda pieaugums.

Mehānismu vieglāk saprast, salīdzinot to ar rezerves ģeneratoru. Metilēnzilais darbojas kā alternatīvs elektronu pārnesējs, kas pieņem reducējošos ekvivalentus un nodod tos citohroma c un IV kompleksa virzienā, tādējādi atbalstot elektronu plūsmu un ATP sintēzi un vienlaikus samazinot elektronu noplūdi agrākajos pārneses posmos. Izteikta trūkuma laikā šī stimulācija ir nelabvēlīga, jo tā palielina vielmaiņas vajadzības, kad skābekļa un glikozes gandrīz nav, un tas var ātrāk izsmelt pēdējās rezerves. Pēc substrātu pieejamības atjaunošanas tā pati īpašība kļūst par priekšrocību, jo palīdz bojātajiem mitohondrijiem efektīvi izmantot atkal pieejamo skābekli un glikozi. Tāpēc arī mitohondriju elektronu pārneses skaidrojumos minētie rezultāti jāvērtē, ņemot vērā šos trūkuma apstākļus.

Viena piebilde: šis ievadīšanas laika princips attiecas uz konkrēto astrocītu preparātu. Saistītā šūnu pētījumā ar citu šūnu tipu, mazāk izteiktu trūkumu un zemāku koncentrāciju aizsardzība tika novērota pat tad, ja viela bija klātesoša trūkuma laikā. Šūnu tips, atlikušais skābeklis, koncentrācija un protokols nosaka, vai ietekme būs labvēlīga vai nelabvēlīga.

Hroniski samazināta asins plūsma: atmiņa, citohroma oksidāze un asinsvadi vairāku nedēļu garumā

Hroniskajos eksperimentos nelielas devas ievadīja katru dienu vairāku nedēļu garumā, nevis vienreizēja neatliekama bolusa veidā. Pirmajā pētījumā žurkas ar pastāvīgu miega artēriju nosprostojumu vienu mēnesi katru dienu saņēma 4 mg/kg pēc ikdienas apmācības sesijas, lai ietekmētu atmiņas nostiprināšanos, nevis tūlītējo sniegumu. Dzīvnieki ar nosprostotām artērijām lēnāk apguva vizuālās atšķiršanas uzdevumus un sliktāk izpildīja sarežģītu atmiņas pārbaudi, savukārt peldēšanas spēja, kustību aktivitāte un smaržu atpazīšana netika ietekmēta. Ikdienas ārstēšana mazināja mācīšanās un atmiņas traucējumus, nemainot vispārējo motorisko uzvedību.

Turpmākā pētījumā pēc tās pašas viena mēneša shēmas noteica citohroma oksidāzes — mitohondriju IV kompleksa — aktivitāti 44 smadzeņu reģionos. Nosprostojums samazināja enzīma aktivitāti redzes, prefrontālajā un peririnālajā garozā, kā arī hipokampā un amigdalā, un vājināja saskaņoto aktivitāti starp redzes garozu un hipokampu. Ārstēšana saglabāja reģionālo enzīma aktivitāti un stiprināja šīs starpreģionālās vielmaiņas korelācijas, un saglabātā aktivitāte korelēja ar labāku uzdevumu izpildi. Šīs korelācijas raksturo saskaņotu vielmaiņas enzīma aktivitāti, nevis tiešus cilvēka smadzeņu funkcionālās savienotības mērījumus; šo atšķirību palīdz izprast pārskati par smadzeņu enerģijas vielmaiņu.

Atsevišķā vienu nedēļu ilgā pētījumā izmantoja 2 mg/kg dienā un pievienoja signālceļa inhibitoru, lai pārbaudītu mehānismu. Ārstēšanas laikā smadzeņu asins plūsma palielinājās no aptuveni 60 līdz aptuveni 100 mL uz 100 g minūtē, un hipokampa asinsvadu blīvums pieauga no aptuveni 15.1 līdz 23 procentiem. Abi uzlabojumi daļēji mazinājās, bloķējot PI3K/Akt šūnu izdzīvošanas signālceļu, un ārstēšanas laikā palielinājās fosforilētā Akt līmenis. Asins plūsmas, asinsvadu blīvuma, barjeras un neironu rezultāti norāda uz neirovaskulāru aizsardzību, kas saistīta ar PI3K/Akt signalizāciju, nevis tikai uz vielmaiņas ietekmi.

Kāpēc nekas no tā nav pielīdzināms neatliekamai insulta aprūpei

Kontrolētie laboratorijas apstākļi ir iemesls, kāpēc šos rezultātus nevar tieši pārnest uz klīnisko praksi. Kultivētām šūnām nav tromba vai farmakokinētikas. 2VO modelis atspoguļo ilgstoši samazinātu globālo asins plūsmu, nevis pēkšņu fokālu emboliju ar tikai dažas minūtes senu penumbru. Pat žurku MCAO modeļos izmanto jaunus, veselus dzīvniekus, anestēziju, vienādus nosprostojumus un precīzi noteiktu devu ievadīšanas laiku, atšķirībā no vecākiem pacientiem ar dažādiem trombiem, aterosklerozi, hipertensiju, diabētu un nezināmu simptomu sākuma laiku.

Nevienā publicētā randomizētā pētījumā ar cilvēkiem nav pierādīts, ka metilēnzilais būtu neatliekams līdzeklis akūta išēmiska insulta ārstēšanai. Dažkārt citētā attēldiagnostikas pētījumā ar cilvēkiem piedalījās 26 veseli pieaugušie, nevis insulta pacienti, un viena perorāla deva mainīja ar uzdevumu saistītos smadzeņu signālus, nedaudz uzlabojot informācijas atsaukšanu atmiņā. Tas parāda ietekmi uz centrālo nervu sistēmu, nevis efektivitāti insulta gadījumā. Pašreizējās neatliekamās aprūpes vadlīnijas turpretī uzsver ātru reperfūziju ar intravenozu trombolīzi pacientiem, kuri atbilst kritērijiem, un trombektomiju atbilstošu lielo asinsvadu nosprostojumu gadījumā; standarta neatliekamās insulta aprūpes algoritmi joprojām ir vienīgais pierādītais ceļš. Ja ir aizdomas par insultu, aprūpi nekad nedrīkst aizkavēt, lai ievadītu metilēnzilo, un preklīnisko devu ekstrapolācijas praktiskie ierobežojumi izskaidro, kāpēc žurkām izmantotās shēmas nevar uzskatīt par klīniskām ārstēšanas shēmām.

Drošuma apsvērumi šo robežu vēl vairāk nostiprina. Intravenozajam metilēnzilajam ir brīdinājums melnā rāmī par smaga vai letāla serotonīna sindroma risku, ja to kombinē ar serotonīnerģiskām zālēm, tostarp SSRI, SNRI un MAO inhibitoriem, ko lieto daudzi pacienti vecumā, kurā bieži sastopams insults. G6PD deficīta gadījumā tas ir kontrindicēts hemolīzes riska dēļ. Tas arī kavē slāpekļa monoksīda signalizāciju, kas dažos apstākļos palielina asinsvadu pretestību un spiedienu, tāpēc to nevajadzētu raksturot vienkārši kā līdzekli, kas palielina smadzeņu asins plūsmu. Apstiprinātā intravenozā 1 mg/kg shēma iegūtas methemoglobinēmijas ārstēšanai nav insulta ārstēšanas shēma.

Godīgs kopsavilkums ir šaurs, bet pamatots. Reperfūzijas laikā pārejošas fokālas išēmijas modelī nelielas metilēnzilā devas žurkām mazināja bojājuma attīstību. Pastāvīga nosprostojuma apstākļos tas aizkavēja infarktu, bet to nenovērsa. Astrocītos tas kaitēja izteikta skābekļa un barības vielu trūkuma laikā, bet palīdzēja reoksigenācijas laikā. Hroniskas hipoperfūzijas apstākļos tas vairāku nedēļu garumā saglabāja citohroma oksidāzi, asinsvadus un atmiņu. Viens elektronu pārnesējs, trīs apstākļi, trīs atbildes.