Metilēnzilais un Bartonella: laboratorijas rezultāti un klīnisko pierādījumu ierobežojumi

Kultūras traukam un pacientam ir kopīgs vārds — infekcija —, taču ne tā nozīme. Traukā infekciju raksturo koloniju skaits uz agara. Pacientā tās ir baktērijas šūnās un asinsvados, zāles, kas pārvietojas caur asinīm un audiem, un imūnsistēma, kas veic daļu darba. Sajaucot šos divus kontekstus, iespaidīgs laboratorijas skaitlis sāk izskatīties pēc ārstēšanas metodes. Nošķirot tos, tas pats skaitlis kļūst par to, kas tas patiesībā ir: pamatojumu nākamajam eksperimentam.

Šī nošķiršana ir galvenais uzdevums šajā pārskatā par metilēnzilo un Bartonella. Vienas pētnieku grupas divos laboratorijas pētījumos metilēnzilais tika pārbaudīts pret Bartonella henselae neaugošā stāvoklī. Abos tika ziņots par spēcīgu aktivitāti stikla un plastmasas traukos. Nevienā tas netika pārbaudīts cilvēkiem.

Kāpēc pētnieki pārbauda stationāro fāzi

Lielākajā daļā antibiotiku pārbaužu izmanto augošas šūnas. Šis modelis neaptver sarežģītāku gadījumu: šūnas, kas pārstājušas dalīties un panes zāles, kuras iznīcina to augošās līdzinieces.

Bartonella var ilgstoši saglabāties organismā, tostarp eritrocītos un endotēlija šūnās. Tāpēc pētnieku grupa noskaidroja, kuras apstiprinātās zāles spēj iznīcināt B. henselae pēc tās pārejas stationārajā fāzē. Zema MIC pret augošām šūnām neļāva paredzēt iznīcināšanu stationārajā fāzē. Rifampicīnam bija ļoti zema MIC, tomēr tas vāji iznīcināja stationārās šūnas, savukārt savienojumi ar augstākām MIC vērtībām tās iznīcināja labi. Lasītāji, kuri vēlas vispārīgu pieeju šāda veida publikāciju lasīšanai, to atradīs metilēnzilā pētījumu lasīšanas ceļvedī.

Pirmā skrīninga pārbaude: Li un kolēģi, 2019

2019. gada stationārās fāzes skrīninga pētījumā žurnālā Antibiotics izmantoja vienu celmu — B. henselae JK53 —, kas tika audzēts Schneider barotnē ar 10 procentiem liellopu augļa seruma 37 C temperatūrā un 5 procentu CO2 vidē. Vienu dienu vecās kultūrās pārsvarā bija izkliedētas, dalošās šūnas. Piecas dienas vecās kultūras ar aptuveni 10 pakāpē 8 koloniju veidojošām vienībām uz mL tika uzskatītas par stationārās fāzes kultūrām un saturēja redzamus agregātus.

Pārbaudē izmantoja SYBR Green I kopā ar propīdija jodīdu, kalibrējot to pret dzīvu un ar izopropanolu nonāvētu šūnu maisījumiem. Tā kā metilēnzilais ir intensīvi krāsots, pozitīvie skrīninga rezultāti tika apstiprināti ar mikroskopiju un pēc tam ar koloniju skaitīšanu uz asins agara — stingrāku galarezultāta kritēriju.

Pārbaudot 1,581 apstiprinātas zāles 50 mikromolārā koncentrācijā, pēc metilēnzilā iedarbības dzīvotspēja pēc mikroplašu lasītāja mērījumiem bija 16 procenti, bet pēc mikroskopijas — 25 procenti. Daptomicīnam tā bija 21 procents, vairākiem azoliem — 22 līdz 27 procenti, gentamicīnam — 32 procenti, eritromicīnam — 66 procenti, ciprofloksacīnam — 74 procenti. Pirvīnija pamoāts pēc lasītāja mērījumiem šķita iedarbīgāks, taču tā paša fluorescences dēļ to nevarēja novērtēt ar mikroskopiju.

Pret augošām B. henselae metilēnzilā MIC bija 0.08 līdz 0.16 mikrogrami uz mL. Iedarbojoties uz piecas dienas vecām stationārām šūnām 5 mikrogramu uz mL koncentrācijā, pēc vienas dienas koloniju skaits samazinājās līdz līmenim, kurā kolonijas vairs nebija konstatējamas, līdzīgi kā daptomicīnam un pirvīnija pamoātam to pārbaudītajās koncentrācijās. Atsevišķā iznīcināšanas dinamikas eksperimentā izmantoja 10 mikrogramus uz mL. Tās ir laboratorijā izmantotās iedarbības koncentrācijas, nevis devas, un publikācijā tās tā arī ir norādītas. Citētais cilvēka maksimālās koncentrācijas plazmā rādītājs — aptuveni 3.9 mikrogrami uz mL — publikācijā minēts tikai kā konteksts. Metilēnzilā farmakokinētikas pārskatā izskaidrots, kāpēc plazmas rādītāju nevar uzskatīt par koncentrāciju audos.

Publikācijā skaidri norādīti divi ierobežojumi. Netika izmantots bioplēves modelis un netika pārbaudītas metilēnzilā kombinācijas. Piecas dienas vecie agregāti bija sakopojumi stationārā šķidrā kultūrā, nevis validēts bioplēves eksperiments. Autori aicināja veikt pētījumus ar dzīvniekiem, kombinācijām un bioplēvēm, kā arī pārbaudīt citas Bartonella sugas.

Kombinācijas un no bioplēves iegūtas šūnas: Zheng un kolēģi, 2020

2020. gada turpinājuma pētījumā žurnālā BMC Microbiology saglabāja to pašu celmu un barotni, bet pārgāja uz sešas dienas vecām stationārām kultūrām un pievienoja divus elementus, kuru pirmajā publikācijā nebija: divu zāļu kombinācijas un no bioplēves iegūtu šūnu modeli.

Pārbaudot atsevišķas zāles vienādā 5 mikrogramu uz mL koncentrācijā 24 stundas, pēc metilēnzilā iedarbības palika 3.2 reiz 10 pakāpē 4 koloniju veidojošas vienības uz mL, savukārt kontrolē bija aptuveni 2.8 reiz 10 pakāpē 10. Ciprofloksacīns, gentamicīns un nitrofurantoīns tajā pašā laika punktā atstāja mazāk koloniju. Tas atšķiras no 2019. gada rezultāta, kad tajā pašā nominālajā koncentrācijā pēc vienas dienas nebija konstatējamu koloniju. Kultūru vecums, blīvums un apstrāde atšķīrās, tāpēc iznīcināšanas efekts bija atkārtojams pēc tā virziena, bet ne vienāds pēc apmēra. Šīs atšķirības starp eksperimentiem ir viens no iemesliem, kāpēc standarta drošības un mijiedarbības pārbaudēs laboratorijā novēroto iedarbīgumu nošķir no klīniskā efekta.

Kombināciju skrīnings ir visvairāk citētā pētījuma daļa. Katras sastāvdaļas koncentrācija bija noteikta 5 mikrogramu uz mL līmenī. Gan azitromicīns kopā ar metilēnzilo, gan rifampicīns kopā ar metilēnzilo pēc 24 stundām neatstāja konstatējamas stationārās fāzes kolonijas; tāds pats rezultāts bija abiem ciprofloksacīna pāriem. No 25 pārbaudītajiem pāriem šādu rezultātu deva tikai šie četri. Formāla sinerģijas analīze netika veikta, tāpēc pareizais apzīmējums ir aktīva kombinācija šajos apstākļos, nevis pierādīta sinerģija.

Bioplēves eksperimentā pārbaudīja šūnas, kas iegūtas no jaunas, izjauktas bioplēves, nevis zāļu iekļūšanu neskartā, nobriedušā bioplēvē. Kultūras audzēja piecas dienas, atšķaidīja un ievietoja daudziedobju platēs vēl uz piecām dienām, bioplēvi apstiprināja ar kristālvioletā krāsojumu un tad pirms zāļu iedarbības nokasīja. Lietojot tikai metilēnzilo 5 mikrogramu uz mL koncentrācijā, līdz 6. dienai skaits samazinājās līdz 2.3 reiz 10 pakāpē 2 — vienam no labākajiem atsevišķu līdzekļu rezultātiem, taču ne līdz nullei. Abas metilēnzilā kombinācijas līdz 6. dienai sasniedza nulli, tāpat kā abas ciprofloksacīna kombinācijas.

Autori norādīja uz tiem pašiem ierobežojumiem, kurus pamanītu uzmanīgs lasītājs: jauna, nokasīta bioplēve, nevis veca, neskarta bioplēve; viena ērti izmantojama koncentrācija visām zālēm, nevis katru zāļu reālistiskā maksimālā koncentrācija; tikai atlasīti pāri ar azitromicīnu vai rifampicīnu; viens celms; nekādu dzīvnieku un nekādu pacientu. Turpmāki pētījumi ar trīs zāļu kombinācijām tika ierosināti, nevis aprakstīti kā veikti.

Pētījumu dizaina salīdzinājums

Tabulā koncentrētā veidā apkopota šī raksta būtība. Viss pa kreisi no pēdējās kolonnas ir darbs ar kultūrām. Nekas no abām publikācijām neietilpst pēdējā kolonnā.

Bartonella nav Borrelia

Abās publikācijās pieminēta Borrelia burgdorferi — Laimas slimības spirohēta —, jo krāsvielu pārbaudes metode tika pārņemta no agrākiem Borrelia stationārās fāzes pētījumiem tajā pašā laboratorijā, kuros arī metilēnzilais un daptomicīns bija uzrādījuši pozitīvus skrīninga rezultātus. Šī vēsture ir noderīgs konteksts un biežs kļūdu avots.

Nevienā eksperimentā abās Bartonella publikācijās Borrelia netiek pārbaudīta paralēli Bartonella. Organismi atšķiras, barotnes atšķiras, koncentrācijas atšķiras, un hipotētiskā metilēnzilā ietekme uz Bartonella membrānu tika norādīta kā pieņēmums, kam vajadzīga papildu izpēte. Rezultātus nedrīkst attiecināt no vienas sugas uz citu, un neviena no publikācijām nepamato plašus apgalvojumus par parazītiem. Tieši šī iemesla dēļ Borrelia un Bartonella persisteršūnu salīdzinājumā abu organismu pētnieciskā literatūra tiek nošķirta.

Kāpēc kultūru rezultāti nekļūst par protokolu

Interese meklēt metilēnzilā lietošanas protokolu Bartonella gadījumā ir saprotama. Šīs publikācijas parāda, kāpēc šāda frāze jāuztver kā brīdinājuma signāls, nevis iepirkumu saraksts.

Pirmkārt, 5 mikrogrami uz mL iedobē nav zāļu nozīmējums. Šis rādītājs neietver uzsūkšanos, izkliedi, saistīšanos ar olbaltumvielām, iekļūšanu šūnās vai panesamību. Autori to izvēlējās kā aptuvenu antibiotiku maksimālo koncentrāciju vidējo vērtību un norādīja, ka turpmākajā darbā katras zāles jāizmanto to reālistiskajā koncentrācijā.

Otrkārt, nulle koloniju nozīmē, ka šajos izsēšanas apstākļos nav koloniju, nevis ka audi ir sterili. Persisteršūnas, intracelulārās baktērijas un paraugu ņemšanas ierobežojumi paliek ārpus agara plates tvēruma.

Treškārt, kombinācijas, kas sterilizē iedobi, organismā var nedarboties vai nodarīt kaitējumu. Azitromicīns kopā ar metilēnzilo un rifampicīns kopā ar metilēnzilo ir laboratorijā pārbaudīti pāri laboratorijas iedarbības apstākļos. Bez farmakokinētikas pētījumiem ar dzīvniekiem un kontrolētiem datiem par cilvēkiem nav noteikta ne deva, ne ilgums, ne ieguvuma un riska attiecība. Ikvienam, kurš apsver iespējas, tās būtu jāpārrunā ar ārstu un pirms jebkādu secinājumu izdarīšanas no kultūras trauka datiem jāiepazīstas ar to, kad metilēnzilā lietošanai nepieciešama medicīniska uzraudzība.

Šīs publikācijas pamato tikai šauru secinājumu: metilēnzilajam ir atkārtojama aktivitāte pret neaugošām B. henselae JK53 in vitro, tostarp divu zāļu kombinācijās laboratorijā, un spēcīgākie kombināciju un no bioplēves iegūtu šūnu rezultāti nāk no 2020. gada pētījuma. Viss pārējais, tostarp tas, vai šī aktivitāte ir nozīmīga cilvēku bartonelozes gadījumā, joprojām nav pārbaudīts.