Metilēnzilā absorbcijas spektrs un molārā absorptivitāte: uzziņa ar norādītiem apstākļiem

Metilēnzilā spektrs šķiet vienkāršs, līdz mēģināt atkārtoti izmantot kādu no tā iegūtu skaitli. Viena laboratorija ziņo par molāro ekstinkcijas koeficientu ap 82,000. Cita norāda 67,000. Trešā — vairāk nekā 100,000. Visas trīs vērtības var pareizi raksturot attiecīgos mērījumus, taču neviena no tām nav universāla šīs krāsvielas konstante.

Neskaidrība rodas, sajaucot divus atšķirīgus jēdzienus. Optiskais blīvums ir konkrēta šķīduma mērījums konkrētā kivetē. Molārā absorptivitāte, ko bieži apzīmē ar epsilon, ir šī šķīduma modeļa parametrs. Mainoties metilēnzilā asociācijas stāvoklim, mainās modelis un līdz ar to arī parametrs. Lietderīgi ir katru koeficientu uztvert kā vērtību ar norādītiem apstākļiem: kopā ar skaitli jānorāda viļņa garums, šķīdinātājs, pH vai buferšķīdums, temperatūra, koncentrācijas diapazons un optiskā ceļa garums.

Monomēra josla atšķaidītā ūdens šķīdumā

Atšķaidītā ūdens šķīdumā metilēnzilā katjona dominējošā josla atrodas ap 664 līdz 665 nm; atkarībā no instrumenta un kalibrēšanas izvēles parasti tiek norādīts diapazons no 664 līdz 668 nm. Šī josla ir piemērota kvantitatīvai noteikšanai, ja šķīdums ir pietiekami atšķaidīts un lielākā daļa krāsvielas ir monomēra formā.

Trīs literatūrā norādītas vērtības parāda, kāpēc apstākļi ir svarīgāki par pašu skaitli. Mālu pētnieki, kuri ūdens paraugos uzturēja koncentrāciju zem aptuveni 7 mikromolāriem un izmantoja 1 cm kivetes, ziņoja par epsilon aptuveni 82,000 M-1 cm-1 pie 665 nm. Šī vērtība ir īpaši labi dokumentēta kā empīriskās kalibrēšanas taisnes slīpums ļoti atšķaidītiem ūdens paraugiem. Vēlākā primārajā kalibrēšanā dejonizētā ūdenī, izmantojot koncentrāciju no 2.34 līdz 37.52 mikromolāriem un 1 cm optisko ceļu, kopējai krāsvielai tika iegūti aptuveni 67,100 M-1 cm-1 pie 665 nm. Zemākais rezultāts ir sagaidāms, nevis pretrunīgs, jo šī kalibrēšanas diapazona augšējā pusē jau ir ievērojams dimēra daudzums. Trešā vērtība, aptuveni 73,460 M-1 cm-1 pie 664 nm, iegūta pētījumā pie pH 6.86 un 293 K, kurā novērotais spektrs tika sadalīts monomēra un dimēra komponentēs, kā apkopots nesenā kritiskā pārskatā par metilēnzilā fotofiziku. Šis skaitlis raksturo ar dekonvolūciju iegūtu monomēra komponenti, nevis tieši noteiktu optiskā blīvuma atkarības slīpumu no kopējās krāsvielas koncentrācijas.

Praktiskais secinājums: izvēlieties koeficientu, kura noteikšanas apstākļi atbilst jūsu paraugiem, vai veiciet savu kalibrēšanu. Neizmantojiet 82,000 analīzē ar 30 mikromolāru šķīdumu fosfātu buferī, pieņemot, ka linearitāte joprojām saglabājas.

Īsāku viļņu garumu plecs ir vairāku ieguldījumu summa

Palielinoties koncentrācijai, plecs ap 600 līdz 615 nm kļūst izteiktāks attiecībā pret 664 nm maksimumu. Mūsdienu pētījumos H tipa dimēra ieguldījums parasti tiek novietots ap 605 līdz 610 nm. Metilēnzilā ūdens šķīdumu globālā spektrālā analīze izšķir dimēra maksimumu pie 607 nm un augstākas kārtas agregāta maksimumu pie 600 nm, kā arī monomēra rezonanses komponentes pie 664 un 650 nm. Pilnais teksts ir pieejams atvērtās piekļuves ierakstā ar PMID 33251415.

Šo plecu nedrīkst apzīmēt kā tikai dimēra optisko blīvumu. Tajā pašā reģionā ieguldījumu dod arī monomēra vibroniskā struktūra, tāpēc izmērītais augstums ir vairāku ieguldījumu superpozīcija. Vienā globālās pielāgošanas analīzē konstatēts, ka monomēra un dimēra modelis nav pietiekams visā diapazonā no 1.1 mikromolāriem līdz 3.4 milimolāriem, savukārt tetramēra pievienošana nodrošināja vislabāko atbilstību; tetramēra signāls bija nosakāms jau zem 34 mikromolāriem. Pielāgotajām komponentēm iegūtās vērtības bija lielas: aptuveni 107,800 M-1 cm-1 pie 664 nm galvenajai monomēra komponentei, aptuveni 101,400 dimēram pie 607 nm un aptuveni 138,500 tetramēram pie 600 nm. Apstākļi bija dejonizēts ūdens bez buferšķīduma, nātrija hlorīda koncentrācija no 0 līdz 0.15 M un temperatūra no 282 līdz 333 K. Tās ir ar modeli izšķirtas komponentes, tāpēc tās nedrīkst izmantot empīriski noteikta Bēra–Lamberta sakarības slīpuma vietā.

Dimerizācijas izteiktība ir noteikta arī tieši. Pie pH 6.86 un 293 K vienā pētījumā iegūta dimerizācijas konstante ap 3,900 M-1. Šāds lielums izskaidro, kāpēc 5 mikromolārs darba šķīdums uzrāda gandrīz lineāru sakarību, bet 50 mikromolārs pamatšķīdums — ne. Metodes izstrādes laikā lietderīgi pārbaudīt optiskā blīvuma attiecību pie aptuveni 610 nm un pie aptuveni 665 nm. Ja šī attiecība palielinās līdz ar koncentrāciju, epsilon pie 664 nm vairs neraksturo vienu nemainīgu ķīmisko formu.

Koncentrācijas intervālā, kurā dominē divas savstarpēji pārvēršamas formas, spektriem var būt kopīgs izosbestiskais punkts; ūdens šķīdumu sērijās tas eksperimentāli novērots ap 625 nm. Skaidri izteikts, nekustīgs punkts atbilst divu dominējošu formu klātbūtnei. Ja, palielinoties koncentrācijai, punkts pārvietojas vai izzūd, uztveriet to kā brīdinājumu par augstākas kārtas agregātu parādīšanos vai līdzsvaru nobīdi, nevis kā instrumenta kļūdu.

Šķīdinātājs, pH un temperatūra maina spektru

Ūdens veicina asociāciju. Dimetilsulfoksīda pievienošana nomāc dimerizāciju, pārbīda absorbcijas un fluorescences maksimumus uz garākiem viļņiem un palielina fluorescences kvantu iznākumu aptuveni četras reizes, kā norādīts pētījumā par šķīdinātāja ietekmi uz metilēnzilo ūdens un DMSO maisījumos, kas indeksēts ar PMID 30933781. Šajā darbā ūdens šķīdumu spektri aplūkoti kā monomēra un dimēra līdzsvars, monomēra absorbcijai atrodoties ap 650 līdz 670 nm un dimēra absorbcijai — ap 580 līdz 615 nm; dimerizācijas konstantes iegūtas no spektriem pie 293.15 K.

Spirti maina gan maksimuma novietojumu, gan šķietamo absorptivitāti, taču pilnībā nenovērš agregāciju. Vienā primārā salīdzinājumā pie 31.3 mikromolāriem un istabas temperatūras, kas aprakstīts pētījumā par šķīdinātāja ietekmi uz metilēnzilo, garo viļņu maksimums ūdenī bija 665 nm, bet metanolā — 655 nm, un visa šķīduma šķietamās vērtības bija ap 37,100 ūdenī un 60,800 metanolā. Atsevišķā validācijā absolūtā etanolā pie 298 K iegūts maksimums pie 655 nm un epsilon ap 68,000.

Parastas pH izmaiņas ietekmē spektru mazāk, nekā pieņemts daudzos protokolos. Iepriekš minētajā kritiskajā pārskatā ziņots, ka diapazonā no aptuveni pH 2 līdz pH 12 maksimums saglabājās ap 665 nm, bet līdz pH 11 absorptivitāte mainījās tikai nedaudz. Buferšķīduma sastāvs un jonu stiprums var ietekmēt rezultātus tikpat būtiski kā nominālais pH, tāpēc pierakstiet faktiski izmantoto buferšķīdumu un sāli, nevis tikai pH metra rādījumu. Stipri skāba vai stipri sārmaina vide ir atsevišķs gadījums, jo krāsviela var ķīmiski pārveidoties, nevis tikai atgriezeniski asociēties. Arī temperatūra un sāls maina līdzsvaru, tāpēc 2020. gada ūdens šķīdumu pētījumā abi faktori tika mērķtiecīgi variēti.

Mērīšana, kas saglabā vērtības derīgumu

Kvantitatīvā darba pamatā ir Bēra–Lamberta sakarība: optiskais blīvums ir vienāds ar epsilon, koncentrācijas un optiskā ceļa garuma reizinājumu. Vienlaikus jāpierāda, ka lineārais intervāls jūsu apstākļos patiešām saglabājas.

Mērījumiem pie zemas mikromolāras koncentrācijas izmantojiet 1 cm kiveti. Ja epsilon ir ap 82,000, pie 5 mikromolāriem optiskais blīvums ir ap 0.41, bet pie 10 mikromolāriem — aptuveni 0.82. Mērījumos, kas vērsti uz monomēru tīrā ūdenī, drošāk ir uzturēt koncentrāciju ap 5 līdz 7 mikromolāriem vai zemāk, nevis kalibrēt līdz koncentrācijām vairāku desmitu mikromolāru apmērā. Koncentrētiem pamatšķīdumiem saīsiniet optisko ceļu, nevis samierinieties ar optisko blīvumu, kas ievērojami pārsniedz 1.

Nulles mērījumam izmantojiet identisku matricu: tādas pašas kvalitātes ūdeni, tādu pašu līdzšķīdinātāja īpatsvaru, to pašu buferšķīdumu un sāļus, tikai bez krāsvielas. Kalibrēšanas šķīdumus sagatavojiet tajā pašā matricā un tajā pašā temperatūrā. Metodes izstrādes laikā skenējiet visu redzamās gaismas diapazonu, ideālā gadījumā aptuveni 550 līdz 750 nm, nevis nolasiet tikai vienu viļņa garumu. Vērojiet spektra formu, ne tikai augstumu. Ja secīga atšķaidīšana maina normalizēto formu, sistēmas ķīmiskais stāvoklis ir atkarīgs no koncentrācijas. Stabils maksimums un stabila optiskā blīvuma attiecība pie 610 un 665 nm ir pārliecinošāki pierādījumi pieņemamam diapazonam nekā tikai augsta R kvadrāta vērtība.

Dokumentējiet reaģenta formu. Komerciālais materiāls var būt bezūdens metiltionīnija hlorīds vai hidrāts, piemēram, trihidrāts, tāpēc pamatšķīduma aprēķinos izmantotajai molmasai jāatbilst faktiskajam pudeles saturam. Šis solis vien izskaidro daļu no laboratorijās norādīto nominālo molāro koncentrāciju atšķirībām. Līdzīga precizitāte vajadzīga, ja rezultātus izmanto kvantitatīvās analīzes aprēķinos, ja spektri palīdz pārbaudīt formulējuma stabilitāti un ja piemaisījumu profilu dēļ nepieciešams izvērtēt tīrību un specifikāciju.

Kopsavilkums ar norādītiem apstākļiem

Izmantojiet šo tabulu kā sākotnēju veidni laboratorijas pierakstiem, nevis kā savstarpēji aizvietojamu konstanšu avotu.

Tātad metilēnzilā absorbcijas viļņa garumu var raksturot ar īsu atbildi, kurai vajadzīga gara piezīme. Norādiet izmērīto maksimumu, šķīdumu, kurā to mērījāt, un koncentrāciju mērījuma laikā. Šāds ieradums neļauj vienai atšķaidīta ūdens šķīduma vērtībai ap 664 nm kļūt par maldīgu universālu konstanti.